一種低聚糖酯及其在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗佐劑原料的制備及疫苗制備領(lǐng)域，具體涉及一種低聚糖酯及其在 制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 聯(lián)合國糧農(nóng)組織和國際獸疫局將口蹄疫疾病列為其成員國共同防范的A類傳染 病中的第一位傳染病。"國家中長期科學(xué)與技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要"將"畜禽健康養(yǎng)殖與疫病防 控"列為農(nóng)業(yè)重點(diǎn)領(lǐng)域中的急需關(guān)鍵技術(shù)。我國每年僅獸用口蹄疫疫苗用量豬84. 15億頭 份，牛羊22. 02億頭份，而且每年在以10%的速度遞增。因此疫苗的市場需求量很大。
[0003] 疫苗佐劑可以提高疫苗的免疫作用效果，其在免疫中的主要作用是提升機(jī)體免疫 系統(tǒng)對抗原或免疫原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)免疫反應(yīng)強(qiáng)度和反應(yīng)的持久性，從而提高機(jī)體 對病毒或細(xì)菌的抵抗力。常見佐劑主要包括鋁鹽佐劑、油乳佐劑、表面活性劑類佐劑、細(xì)菌 微生物類佐劑、蜂膠佐劑、細(xì)胞因子類佐劑等。
[0004] 目前國內(nèi)W/0/W (水包油包水）型油乳佐劑，全部依賴于法國SEPPIC公司生產(chǎn)的 206佐劑，進(jìn)口額高達(dá)3億元/年。由于法國一直實(shí)行嚴(yán)格的技術(shù)封鎖，不轉(zhuǎn)讓不合作新型 佐劑技術(shù)，因此我國迫切需要研發(fā)能與法國206技術(shù)水平相當(dāng)?shù)男滦鸵呙缱魟?br>[0005] 206佐劑為W/0/W型佐劑，目前國內(nèi)此類佐劑開發(fā)的技術(shù)瓶頸在于，該類佐劑中需 含有一種親油性表面活性劑，這種表面活性劑與其他表面活性劑復(fù)配使用，可以形成一種 穩(wěn)定的自乳化體系，制備W/0/W乳劑，目前國內(nèi)還沒有找到這樣一種合適的表面活性劑。
[0006] 此外，從國際上表面活性劑品種發(fā)展趨勢來看，表面活性劑開始傾向于生態(tài)安全、 無環(huán)境污染、完全生物降解、功能性強(qiáng)、化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性好、成本低的方向發(fā)展。
[0007] 糖基表面活性劑，是以糖類制成的表面活性劑，原料來自天然可再生資源，環(huán)境相 容性好，有很好的皮膚兼容性和極佳的生物可降解性，在制藥、生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)方面有 著潛在的應(yīng)用前景。因此，糖基表面活性劑正是符合國際表面活性劑發(fā)展需求的產(chǎn)品。
[0008] 糖基表面活性劑可以與其它表面活性劑復(fù)配，不但可以改進(jìn)自身的性能，而且可 以開發(fā)出新的應(yīng)用領(lǐng)域或產(chǎn)品，極大的拓寬了糖基表面活性劑的應(yīng)用領(lǐng)域。因此，利用糖 類資源制備一種親油性的糖基表面活性劑并將其應(yīng)用于制備W/0/W型疫苗佐劑中，以替代 206佐劑，進(jìn)而利用W/0/W型疫苗佐劑制成疫苗便成為了有待解決的難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對以上技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種低聚糖酯的制備方法，并提供低聚 糖酯作為親油性表面活性劑在制備安全、穩(wěn)定的W/0/W型疫苗佐劑以替代206佐劑并最終 制備成動物疫苗中的應(yīng)用。
[0010] 為此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種低聚糖酯，其制備方法如下： (1)聚合反應(yīng)：在氮?dú)舛栊苑諊谋Ｗo(hù)下，將天然單糖于攪拌下加熱至熔融狀態(tài)，反應(yīng) 1-6 h，生成天然單糖聚合物； (2) 酯化反應(yīng)：將分別將油酸和催化劑于攪拌下逐滴加入到天然單糖聚合物中，于 180°C _280°C下反應(yīng)1-6 h，自然冷卻，生成低聚糖酯粗品； (3) 將所述低聚糖酯粗品經(jīng)純化和干燥即可。
[0011] 優(yōu)選地，所述的天然單糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖或木糖中的任何一種；所述 的催化劑為磷酸、亞磷酸、碳酸鈉、磷酸二氫鉀中的一種或幾種的混合物。
[0012] 具體地，步驟（3)中純化的具體步驟為：將所述低聚糖酯粗品用甲醇萃取，萃取液 用NaOH溶液中和、水洗除去未反應(yīng)的磷酸和單糖，最后用正己烷洗除殘留的油酸，蒸去溶 劑，干燥備用。
[0013] 優(yōu)選地，所述油酸和天然單糖的質(zhì)量比為1:0. 5-10,質(zhì)量比催化劑：（單糖+油酸） =1-10:1000 o
[0014] 本發(fā)明還提供了上述的低聚糖酯在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供了包含上述低聚糖酯的疫苗佐劑，其包括如下質(zhì)量百分比的組分： 50-90%獸用注射級輕質(zhì)礦物油，2. 5-15%低聚糖酯，7-30%親水性表面活性劑，0. 5-5%助劑。
[0016] 其中，所述的親水性表面活性劑選自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(優(yōu)選聚氧乙 烯失水山梨醇脂肪酸酯T-20、T-40、T-60、T-80 )、聚氧乙烯蓖麻油(優(yōu)選EL20、EL30、EL40 )、 聚氧乙烯氫化蓖麻油(優(yōu)選HEL20、HEL40)、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯蔗糖脂肪酸 酯中的一種或兩種以上；所述助劑選自聚丙二醇PPG200、PPG400、PPG600、PPG800,維生素 E，BHA (丁基羥基茴香醚），BHT (2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚），角鯊稀，角鯊?fù)橹械囊环N或 兩種以上。
[0017] 上述疫苗佐劑的制備方法為：按比例將所述獸用注射級輕質(zhì)礦物油、低聚糖酯、親 水性表面活性劑和助劑在轉(zhuǎn)速SOOrpm下進(jìn)行攪拌混合，即獲得W/0/W型疫苗佐劑。
[0018] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了由上述疫苗佐劑制備疫苗的方法，其特征在于其步驟如 下：將所述疫苗佐劑于121°c蒸汽滅菌30 min，自然冷卻，放入乳化罐中，控制乳化罐內(nèi)溫 度為30±2°C ;將溫度與乳化罐內(nèi)溫度相同的水相抗原加入到乳化罐中，水相抗原添加量為 所述疫苗佐劑質(zhì)量的100-400% ;將所述疫苗佐劑與水相抗原的混合物在400-1000rpm下進(jìn) 行乳化，乳化溫度為30±2°C，乳化時間為5-30 min，乳化完成后即得疫苗。
[0019] 具體地，所述的水相抗原為口蹄疫抗原、豬圓環(huán)病毒抗原或其他病毒抗原和細(xì)菌 抗原。
[0020] 本發(fā)明制備的低聚糖酯作為親油性表面活性劑可制備得到安全、穩(wěn)定的W/0/W型 疫苗佐劑，最終制備得到的w/0/w型疫苗佐劑可制備成穩(wěn)定性強(qiáng)、安全性好，抗體效價高的 動物疫苗。本發(fā)明解決了親油性表面活性劑的制備難題，打破了法國在w/0/w型油乳佐劑
技術(shù)領(lǐng)域的壟斷。
【附圖說明】
[0021] 圖1為實(shí)施例9中各組別豬圓環(huán)病毒疫苗ELISA抗體水平OD值走向圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用 的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
[0023] -、低聚糖酯的制備實(shí)施例 實(shí)施例1 (1) 在氮?dú)舛栊苑諊Ｗo(hù)下，將450g木糖于120°C加熱使木糖處于熔融狀態(tài)，于400rpm 下攪拌反應(yīng)6h，生成木糖聚合物； (2) 將木糖聚合物升溫至180°C，逐滴加入13. 5 g亞磷酸和900 g油酸，于180°C下進(jìn) 行攪拌，轉(zhuǎn)速400rpm，攪拌反應(yīng)lh，冷卻，生成低聚木糖醋粗產(chǎn)品； (3) 將低聚木糖酯粗產(chǎn)品進(jìn)行甲醇萃取，得到的萃取液用NaOH溶液除去未反應(yīng)的亞磷 酸和木糖，然后用正己烷洗滌除去殘留的油酸，干燥，得到低聚木糖酯。
[0024] 實(shí)施例2 (1) 在氮?dú)舛栊苑諊Ｗo(hù)下，將700g甘露糖于200°C加熱，使甘露糖處于熔融狀態(tài)， 400rpm下攪拌lh，生成甘露糖聚合物； (2) 將甘露糖聚合物升溫至280°C，逐滴加入I. 2 g亞磷酸、0. 6g碳酸