牦牛乳乳清蛋白源ace抑制肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及功能乳品領(lǐng)域，特別涉及兩條牦牛乳乳清蛋白源ACE抑制肽及其制備 方法。 技術(shù)背景
[0002] 隨著社會(huì)的進(jìn)步與發(fā)展，人們生活水平逐漸提高，飲食中脂肪與熱量的比重逐漸 加大，再加上運(yùn)動(dòng)量的減少，我國心血管疾病的發(fā)病率快速上升，其中高血壓占主要地位。
[0003] 高血壓是指在未使用降壓藥物的情況下，收縮壓 2 HOmmHg和(或)舒張壓2 90mmHg。目前，常用于抗高血壓藥物治療的有6種主要的降壓藥 物，它們分別是利尿劑、α-受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素 Π 受體拮抗劑、α-腎 上腺素受體阻滯劑和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。這些降血壓藥物能顯著的降壓，但卻存在 一定的毒副作用，如咳嗽、過敏性血管水腫及腎功能不全加重等。
[0004] 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)抑制肽是經(jīng)過蛋白水解后形成的小分子多肽，它具有顯 著的降血壓作用，更有效的是它與其它普通降壓藥物比較發(fā)現(xiàn)，ACE抑制肽無毒副作用，并 且對(duì)正常的血壓無影響。ACE在血壓調(diào)節(jié)中起重要作用，經(jīng)碳端兩個(gè)氨基酸（His-Leu)的 切除，能夠把原本無活性的血管緊張素 I轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘难芫o張素 II，引起血管收縮， 使血壓上升；ACE還會(huì)使具有血管舒張功能的舒緩激膚失活，同樣又引起血壓上升的情形， ACE抑制肽能夠阻斷ACE引起的兩種生化反應(yīng)過程，起到降血壓的作用。
[0005] ACE抑制肽一般以無活性的形式存在于蛋白質(zhì)序列中，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)通過熱、酸堿的 降解、酶制劑的水解或微生物的發(fā)酵等，無活性的蛋白質(zhì)中可以釋放出具有降壓作用的ACE 抑制肽。ACE抑制肽的制備方法主要有5種：化學(xué)降解法、酶解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成 法和基因工程法，現(xiàn)在研宄最多的是酶解法和微生物發(fā)酵法。相對(duì)于微生物發(fā)酵法，酶法反 應(yīng)迅速，制備ACE抑制肽的活性高，且原料廣泛，主要有乳類蛋白、植物類蛋白及動(dòng)物類蛋 白，目前乳源ACE抑制肽主要是以牛乳為原料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明基于現(xiàn)有的技術(shù)，酶解牦牛乳乳清蛋白制備ACE抑制肽，為降血壓提供無 副作用藥物做出了很大的貢獻(xiàn)。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為： 一種牦牛乳乳清蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)抑制肽，所述ACE抑制肽包括兩條肽， 分別為八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。
[0008] 一種牦牛乳乳清蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽的制備方法，所述制備方 法包括以下步驟： 步驟1 :牦牛乳經(jīng)過脫脂、酸凝沉淀得到上清，將上清液用IM NaOH調(diào)節(jié)pH值5. 2,加熱 溫度達(dá)80-90°C，使之沉淀即為乳清蛋白，凍干得到乳清蛋白凍干粉。
[0009] 步驟2 :將牦牛乳乳清蛋白凍干粉制成乳清蛋白溶液，用中性蛋白酶進(jìn)行水解反 應(yīng)2~4 h，酶與乳清蛋白的比為1500~2000 U/g，調(diào)整乳清蛋白的溫度40°C~50 °C和pH值 6. 5~7. 5,水解2~4h，得到酶解液； 步驟3:將步驟2所得酶解液在90 °C水浴中保持15 min使酶失活，使用高速離心機(jī)在 9000 rpm的條件下離心20 min，除去未水解的乳清蛋白，得到酶解產(chǎn)物； 步驟4 :對(duì)步驟3所述酶解產(chǎn)物進(jìn)行一級(jí)超濾，收集濾液，得到一級(jí)濾液； 步驟5 :對(duì)步驟4所得的一級(jí)濾液進(jìn)行二級(jí)超濾，初步得到具有ACE抑制活性的濾液； 步驟6 :將步驟5所述超濾膜濾過液的多肽組分進(jìn)一步分離分析其活性功能組分，樣品 經(jīng)層析柱分離（Sephadex G-25,凝膠柱2. 6 X 80cm，超純水0.6 mL/min洗脫，波長(zhǎng)檢測(cè)215 rim)，多肽中的組分按分子量大小依次分離，按分離峰的時(shí)間范圍收集洗脫液，分別命名為 E1-E6組分； 步驟7 :將步驟6所述E1-E6組分冷凍干燥保存，配置成多肽溶液，測(cè)定ACE抑制活性 值； 步驟8 :經(jīng)層析分離后獲得的E2、E4和E5組分ACE抑制活性高于其他組分，E5組分含 量占凝膠過濾后收集多肽總量的33. 5 %，高于E2和E4組分，我們選擇E5組分進(jìn)一步分離， 半制備反相液相色譜柱分離E5,將不同洗脫時(shí)間范圍的洗脫液分為5個(gè)組分，多次重復(fù)操 作，收集洗脫液，將有機(jī)溶劑揮發(fā)后冷凍干燥，測(cè)定E5a到E5e組分多肽含量，配置相同濃度 的溶液測(cè)定ACE抑制率，保留時(shí)間段分別為24-26. 5min和31. 9-32. 3min的E5b和E5e組 分的ACE抑制率均大于70 % ; 步驟9 :將反相液譜制備柱分離得到的組分E5b和E5e進(jìn)行液質(zhì)分析，然后利用串聯(lián)質(zhì) 譜對(duì)一級(jí)質(zhì)譜中的肽段氨基酸序列進(jìn)行了分析，得到多肽序列。
[0010] 進(jìn)一步的，所述牦牛如乳清蛋白凍干粉的制備方法包括以下步驟： 步驟1 :將新鮮的牦牛乳高速離心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脫脂乳； 步驟2 :將所得脫脂乳在35-50°C范圍內(nèi)的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌 器進(jìn)行攪拌，邊攪拌邊滴加 IM HCl溶液，使脫脂乳溶液的pH達(dá)到4. 6,使酪蛋白進(jìn)行沉淀， 6000 rpm離心20 min后，得到上清液； 步驟3 :將上清液用采用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，邊攪拌邊滴加 IM NaOH調(diào)節(jié)pH值5. 2， 再加熱至80-90 °C，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm離心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，將其冷 凍干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的凍干粉。
[0011] 進(jìn)一步的，步驟3中所述的一級(jí)超濾處理的條件為： 采用MWCO為10 kDa的超濾膜進(jìn)行一級(jí)超濾：乳清蛋白降血壓多肽濃度5 %，溶液pH 7. 0,操作壓力0· 15 MPa，溫度45°C，超濾時(shí)間2 h。
[0012] 進(jìn)一步的，步驟4中所述的二級(jí)超濾處理的條件為：壓力0. 15 MPa，溫度45°C，pH 值 7.0。
[0013] 采用MWCO為6 kDa的超濾膜對(duì)一級(jí)濾液，進(jìn)行超濾l~3h。
[0014] 進(jìn)一步的，步驟5中所述層析柱為SephadexG-25凝膠層析柱。
[0015] 進(jìn)一步的，所述凝膠層析的條件為：Sephadex G-25,凝膠柱2. 6X80cm，超純水0· 6 mL/min洗脫，波長(zhǎng)檢測(cè)215 nm。
[0016] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為： 本發(fā)明采用酶解牦牛乳乳清蛋白制備出兩條有效地ACE抑制肽，以新鮮牦牛乳為原 料，選材純天然，營養(yǎng)價(jià)值高，牦牛乳乳清蛋白還具有多種生理功能，且含有人體生長(zhǎng)發(fā)育 所必需的氨基酸，酶解后可制備大量的ACE抑制肽，該產(chǎn)品具有用量小、無毒副作用、性質(zhì) 溫和、生理功能強(qiáng)的特點(diǎn)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為凝膠層析分離多肽示意圖。
[0018]
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 一種牦牛乳乳清蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)抑制肽，所述ACE抑制肽包括兩條肽， 分別為八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。
[0020] 一種牦牛乳乳清蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽的制備方法，所述制備方 法包括以下步驟： 步驟1 :將新鮮的牦牛乳高速離心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脫脂乳； 步驟2 :將所得脫脂乳在35-50°C范圍內(nèi)的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌 器進(jìn)行攪拌，邊攪拌邊滴加 IM HCl溶液，使脫脂乳溶液的pH達(dá)到4. 6,使酪蛋白進(jìn)行沉淀， 6000 rpm離心20 min后，得到上清液； 步驟3 :將上清液用采用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，邊攪拌邊滴加 IM NaOH調(diào)節(jié)pH值5. 2， 再加熱至80-90 °C，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm離心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，將其冷 凍干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的凍干粉； 步驟4 :將上述步驟所得乳清蛋白凍干粉制成質(zhì)量濃度為5 %的乳清蛋白溶液100 ml， 用中性蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)3 h，酶與乳清蛋白的比為1800 U/g，用恒溫水浴箱及I M NaOH 溶液分別調(diào)整乳清蛋白的溫度45 °C和pH值7. 0,水解3h ; 步驟5