鮑曼不動桿菌假定蛋白a1s_1523的蛋白及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及鮑曼不動桿菌假定蛋白A1S_1523蛋白及制 備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanni i)是一種常見的非發(fā)酵革蘭陰性桿 菌，在自然界中廣泛存在，可正常定植于人體皮膚表面及腔道內，為條件致病菌，主要可導 致肺炎、血流感染、皮膚及軟組織感染、心內膜炎以及腦膜炎等。隨著其耐藥菌株檢出率的 逐年增高，鮑曼不動桿菌在全球范圍內已成為一種重要的病原菌，據美國NHSN(Nat ional Healthcare Safety Network)的報告，2009至2010年間，其監(jiān)測到的各類院內感染分離到 的鮑曼不動桿菌菌株中，多重耐藥（MDR)株占到了 65 %。我國CHINET細菌耐藥監(jiān)測網數據 顯示，2010年我國10個省市的14家教學醫(yī)院中，臨床分離的鮑曼不動桿菌占所有革蘭陰性 桿菌的16. 11%，位列第三。此外，鮑曼不動桿菌也是軍人作戰(zhàn)中受到戰(zhàn)創(chuàng)傷相關感染的重 要致病菌，美軍在伊拉克、科威特以及阿富汗參加戰(zhàn)斗的傷員中有很高的檢出率。
[0003] 由于鮑曼不動桿菌耐藥性逐年增強，普通抗生素對它的治療作用已不明顯，找到 新的治療方案或新型有效藥物來對抗鮑曼不動桿菌的感染，特別是多重耐藥鮑曼不動桿菌 的感染已成為刻不容緩的任務。介于新的抗生素發(fā)展緩慢，而且鮑曼不動桿菌耐藥性適應 迅速，許多微生物研宄學者開始嘗試利用鮑曼不動桿菌全菌外膜外膜囊泡或外膜蛋白的免 疫原性，誘導機體產生抗鮑曼不動桿菌免疫，從與抗生素完全不同的角度，尋求有效的對抗 耐藥鮑曼不動桿菌的新手段。
[0004] 目前，多個研宄已經證明：滅活全菌外膜蛋白外膜蛋白囊泡和外膜具有良好的免 疫原性和抗原性，他們免疫小鼠的能抵抗鮑曼不動桿菌的感染和侵襲，但從安全性等方面 綜合考慮，外膜蛋白比全菌更為安全，因此，外膜蛋白可能是抗鮑曼不動桿菌的最佳候選抗 原之一。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明提供一種鮑曼不動桿菌假定蛋白A1S_1523重組蛋白，該重組蛋白表達量 高，便于分離純化，高效安全，可以直接與佐劑配合使用，用于制備抗鮑曼不動桿菌感染的 亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明利用反向疫苗學篩選出一種假定蛋白A1S_1523,該蛋白由196個氨基酸殘 基組成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示，其DNA序列如SEQ ID NO. 6所示。利用生物信 息學對A1S_1523蛋白進行結構功能分析，發(fā)現A1S_1523是一種分泌蛋白，由1-21位氨基 酸組成的信號肽引導分泌至胞外（附圖6所示）。本發(fā)明利用A1S_1523蛋白的成熟肽，設 計一種亞單位疫苗。
[0007] 本發(fā)明的技術方案具體如下：
[0008] 鮑曼不動桿菌A1S_1523重組蛋白，包含A1S_1523成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 所述重組蛋白通過標簽蛋白GST融合表達，所述標簽蛋白融合于所述A1S_1523蛋 白的N端。
[0011] 所述重組蛋白的氨基酸序列還包括在SEQ ID NO. 1的氨基端和/或羧基端缺失、 替代、和/或添加了 1 一 20個氨基酸殘基的具有免疫原性的變體，該變體與所述氨基酸序 列具有至少80%的同一性。
[0012] 該重組蛋白由融合表達并酶切后在權利要求1所述的氨基端加入GPLGS五個氨基 酸形成。
[0013] 編碼A1S_1523重組蛋白的多核苷酸。
[0014] A1S_1523重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0015] 1)設計PCR的引物如下：
[0016] 正向引物
[0017] 5'-CGCGGATCCGACTATAAAATGATCCAACACA-3'
[0018] BamH I
[0019] 反向引物
[0020] 5'-TTATGCGGCCGCTTATTTTTTAGCTGCACTAGCC-3'
[0021] Not I
[0022] 2)使用步驟1)設計的引物通過PCR擴增出編碼A1S_1523蛋白目的基因片段；
[0023] 3)步驟2)所得的基因片段克隆至表達載體，然后轉化至宿主菌；
[0024] 4)誘導轉化后的宿主菌表達A1S_1523重組蛋白；
[0025] 5)純化重組蛋白。
[0026] 表達載體或宿主細胞，包含編碼A1S_1523重組蛋白的多核苷酸或宿主細胞。
[0027] 所述載體是pGEX-6P_2表達載體；所述宿主細胞是大腸桿菌，所述大腸桿菌是 XLl-Blue0
[0028] 抗A1S_1523蛋白的抗體。
[0029] 本發(fā)明所述A1S_1523重組蛋白在制備預防或治療鮑曼不動桿菌感染的藥物中的 應用。以及
[0030] A1S_15230重組蛋白在制備鮑曼不動桿菌檢測試劑盒中的應用。
[0031] 本發(fā)明采用基因工程技術克隆表達此保護性抗原A1S_1523重組蛋白，表達量高， 便于分離純化，而且高效安全。A1S_1523重組蛋白可以直接與佐劑（如Al (OH)3佐劑、AlPO4 佐劑、1?59、4503、4504、不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑等）配合使用，優(yōu)選八1?04佐劑用于 肌肉注射免疫。
[0032] 本發(fā)明的基因工程重組蛋白的表達方法具有以下6個優(yōu)點：
[0033] 1.A1S_1523蛋白及從A1S_1523蛋白均未用于重組亞單位疫苗領域，能夠有效激 發(fā)機體引起保護性免疫應答，從而抵御鮑曼不動桿菌致死性感染；
[0034] 2. A1S_1523蛋白的表達質粒在原核表達系統(tǒng)（大腸桿菌）中誘導表達，表達量高， 質量安全可控；
[0035] 3.選擇pGEX-6p-2表達載體，A1S_1523重組蛋白以融合蛋白形式表達，最大限度 保持了其原有的空間構象；
[0036] 4.所表達的融合蛋白中就含有一個GST標簽，此標簽就成為蛋白純化的標記，使 得純化條件溫和、步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而純化后的蛋白能最大限度保持其空 間構象和免疫原性；
[0037] 5. A1S_1523融合蛋白表達率約為30 %，純化后的A1S_1523融合蛋白純度大于 95% ；
[0038] 6. A1S_1523融合蛋白能夠誘導動物產生特異性的抗體。
[0039] 利用本發(fā)明A1S_1523融合蛋白制備的亞單位疫苗可通過皮下（肌肉）注射途徑 進行免疫接種，激發(fā)機體產生IgG抗體和細胞免疫應答。并經動物實驗證實，所述基因工程 重組單價亞單位疫苗具有良好的抗鮑曼不動桿菌感染的免疫保護效果。為進一步的聯合疫 苗和多亞單位融合疫苗研宄打下基礎，同時為防治疫苗和診斷試劑盒的研制及應用具有重 要的作用。
[0040] 為了使本發(fā)明目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本 發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用 于限定本發(fā)明。
【附圖說明】
[0041] 圖1是A1S_1523基因片段的PCR擴增結果，其中，泳道M :核酸（DNA)分子量標準 (Marker);泳道1-2 :A1S_1523基基因片段（540bp)的PCR擴增產物；
[0042] 圖2為表達載體pGEX-6p-2-AlS_1523的酶切鑒定結果：其中，泳道M :核酸（DNA) 分子量標準（Marker);泳道4-6 :重組表達質粒pGEX-6p-2-AlS_1523經酶切后的鑒定結 果，其中泳道4-6均表不酶切后分離的片段4000bp和540bp