一種低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和儀器科學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是基于微流控芯片上液滴包裹和液滴分選的方法實(shí)現(xiàn)低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]活體單細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單元和進(jìn)化的基本單位,從單個(gè)細(xì)胞層面研究細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程有著重要的意義，能夠從本質(zhì)上揭示癌癥發(fā)病機(jī)制，理解細(xì)胞分化與組織發(fā)育原理，識(shí)別基因表達(dá)特性與細(xì)胞特征。
[0003]快速分離、獲取單細(xì)胞已成為單細(xì)胞研究與分析的關(guān)鍵技術(shù)。流式細(xì)胞分選儀在單細(xì)胞分選和分析方面的重要儀器平臺(tái)，是分離細(xì)胞的有效手段。然而由于絕大多數(shù)活體細(xì)胞本身熒光效應(yīng)較弱或沒(méi)有熒光，外加熒光標(biāo)記不適用于活體細(xì)胞篩選。商業(yè)化集成的微流控芯片單細(xì)胞分析儀能實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的某種或某些分析的目的，但是其集成度較高，可擴(kuò)展性不強(qiáng)，價(jià)格昂貴，不易實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的物理分離獲取，限制了對(duì)單細(xì)胞的下游自主化分析，阻礙了其在實(shí)驗(yàn)室研究中的應(yīng)用。目前實(shí)驗(yàn)室研究中常用的單細(xì)胞分離方法還包括激光光鑷、顯微分離和無(wú)限稀釋法。前兩種技術(shù)平臺(tái)價(jià)格昂貴，分離通量較低；無(wú)限稀釋法簡(jiǎn)單方便，但無(wú)法可控分離獲得單細(xì)胞。
[0004]微流控芯片有著尺寸小、試劑消耗量少、高通量、易集成等特點(diǎn)，適用于微體系的研究和分析工作；微液滴作為獨(dú)立的研究與分析單元，使基于微流控芯片的微液滴技術(shù)應(yīng)用到單細(xì)胞研究與分析有著巨大的優(yōu)勢(shì)和前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足之處，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。
[0006]本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是:一種低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)，其特征在于，包括:微流控芯片、液滴信號(hào)檢測(cè)器、信號(hào)分析與分選控制單元、電磁閥、導(dǎo)管、液滴收集微管；
[0007]所述微流控芯片內(nèi)部包括微通道網(wǎng)絡(luò)，用于使流體在外力驅(qū)動(dòng)下在其微流道內(nèi)定向流動(dòng)，液滴的生成和分選，以及廢液、被分選液滴的導(dǎo)出；
[0008]所述液滴信號(hào)檢測(cè)器用于采集流經(jīng)所述微流控芯片的檢測(cè)區(qū)的液滴的光學(xué)信號(hào)，并將其傳送至信號(hào)分析與分選控制單元；
[0009]所述信號(hào)分析與分選控制單元用于分析來(lái)自所述液滴信號(hào)檢測(cè)器的信號(hào)，并控制電磁閥的工作；
[0010]所述電磁閥用于接收所述信號(hào)分析與分選控制單元發(fā)送的分選控制指令，并通過(guò)改變液滴在微流控芯片的運(yùn)動(dòng)方向執(zhí)行相應(yīng)的液滴分選操作；
[0011]所述導(dǎo)管連接所述微流控芯片與電磁閥，用于導(dǎo)出分選的液滴；
[0012]所述液滴收集微管連接所述導(dǎo)管的一端，用于收集所述微流控芯片分選出的滴液。
[0013]所述微流控芯片是由上層和下層基片鍵和而成的，材質(zhì)均可為塑料、玻璃或石英。
[0014]所述微流控芯片的上層包括微通道網(wǎng)絡(luò)，所述微通道網(wǎng)絡(luò)的出入口包括連續(xù)油相入口、細(xì)胞懸浮液入口、側(cè)流油相入口、電磁閥連接口、廢液出口和被分選液滴出口 ；
[0015]所述連續(xù)油相入口所連通的一支微通道和細(xì)胞懸浮液入口所連通的一支微通道連通后，再與所述側(cè)流油相入口、電磁閥連接口、廢液出口和被分選液滴出口連通。
[0016]所述微通道為25-100微米寬，40-60微米深，形成的液滴直徑為30_80微米。
[0017]所述被分選液滴出口為200-250微米寬、200-250微米深的微通道。
[0018]所述液滴信號(hào)檢測(cè)器是高速相機(jī)、熒光檢測(cè)器和拉曼光譜檢測(cè)器中的任意一種。
[0019]所述信號(hào)分析與分選控制單元是由與所述液滴信號(hào)檢測(cè)器相對(duì)應(yīng)的信號(hào)分析軟件和電磁閥控制軟硬件耦合而構(gòu)成。
[0020]所述電磁閥有吸、推兩種分別可控的工作模式。
[0021]一種低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0022]液體注入和液滴的形成:利用壓力驅(qū)動(dòng)油相通過(guò)連續(xù)油相入口進(jìn)入微流控芯片的一支微通道，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞懸浮液水相通過(guò)細(xì)胞懸浮液入口進(jìn)入微流控芯片的另一支微通道，在上述兩支微通道的連接處通過(guò)油相對(duì)水相的剪切作用形成油包水微液滴；
[0023]液滴流向的控制:從側(cè)流油相入口引入的油相，使油包水微液滴在微流道內(nèi)定向流動(dòng)，且默認(rèn)流入廢液出口 ；
[0024]液滴信號(hào)采集和分析:當(dāng)油包水微液滴流經(jīng)液滴信號(hào)檢測(cè)器時(shí)，油包水微液滴的液滴信號(hào)將被采集并傳送到信號(hào)分析與分選控制單元，通過(guò)將所接收的信號(hào)與設(shè)定的分選規(guī)則進(jìn)行比對(duì)，判定所采集的液滴信號(hào)是否滿足所述分選規(guī)則的條件；
[0025]液滴分選:當(dāng)采集的液滴信號(hào)滿足分選條件時(shí)，信號(hào)分析與分選控制單元觸發(fā)電磁閥工作，使油包水微液滴受到電磁閥施加的力，進(jìn)而改變其運(yùn)動(dòng)方向，流向被分選液滴出Π ；
[0026]液滴的收集和單細(xì)胞的獲取:被分選液滴出口處的導(dǎo)管流入液滴收集微管中，實(shí)現(xiàn)單液滴收集并通過(guò)后續(xù)破乳化、提取操作獲取單細(xì)胞。
[0027]所述分選規(guī)則為一個(gè)液滴中包裹有且只有單個(gè)細(xì)胞。
[0028]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0029]1.本發(fā)明有效地利用微流控芯片的微液滴包裹技術(shù)，通過(guò)液滴包裹細(xì)胞的方法，提高了對(duì)單細(xì)胞操控的程度和精確度，尤其是對(duì)尺寸較小的細(xì)胞，此方法的優(yōu)勢(shì)更為突出。
[0030]2.本發(fā)明有效地利用微流控芯片的微液滴分選技術(shù)，通過(guò)對(duì)包裹細(xì)胞的液滴分選，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單細(xì)胞的分離和獲取的目的。
[0031]3.本發(fā)明通過(guò)調(diào)節(jié)電磁閥工作的時(shí)間，有效地控制了液滴所受力的大小，擴(kuò)大此方法對(duì)尺寸不同液滴的適用范圍。
[0032]4.本發(fā)明優(yōu)化了微流控芯片與外界連接的界面結(jié)構(gòu)，解決了微觀與宏觀界面上尺度差異等引起的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了液滴的無(wú)阻滯、高效導(dǎo)出。
[0033]5.本發(fā)明提出的技術(shù)方法提供了一套簡(jiǎn)單可行、適用于不同檢測(cè)方法的液滴分選、細(xì)胞分離與獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)和方法，該方法相比于傳統(tǒng)獲取單細(xì)胞的方法具有效率高、耗時(shí)短、成本低、無(wú)污染、適用范圍廣、可擴(kuò)展性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為分離獲取單細(xì)胞的微流控芯片示意圖:
[0035]其中，1、連續(xù)油相入口 ；2、細(xì)胞懸浮液入口 ；3、側(cè)流油相入口 ；4、電磁閥連接口 ；5、廢液出口 ；6、被分選液滴出口。
[0036]圖2為分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖:
[0037]其中，7、微流控芯片；8、液滴信號(hào)檢測(cè)器；9、信號(hào)分析與分選控制單元；10、電磁閥；11、導(dǎo)管；12、檢測(cè)區(qū)；13、液滴收集微管。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0039]實(shí)施例1:基于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)成像技術(shù)低成本、高效分離獲取單細(xì)胞
[0040]如圖1、2所示，本實(shí)例所構(gòu)建的基于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)成像技術(shù)低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)，微流控芯片7的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，其包括:1、連續(xù)油相入口 ；2、細(xì)胞懸浮液入口 ；3、側(cè)流油相入口 ；4、電磁閥連接口 ；5、廢液出口 ；6、被分選液滴出口。微流控芯片7由上層PDMS和下層玻璃基片鍵和而成，其中上層有25-150微米寬，40-60微米深的微通道網(wǎng)絡(luò)采用濕法刻蝕而得，下層玻璃基片上附著一層約I毫米厚的PDMS，其作用是易于產(chǎn)生油包水液滴和上下兩層的鍵合封接。液滴靠油對(duì)水的剪切形成，通過(guò)加入表面活性劑使其均勻和穩(wěn)定；微流控芯片7的出口和入口通過(guò)固定接口和微管與外界相連，實(shí)現(xiàn)油相和水相的導(dǎo)入，被分選液滴和廢液的導(dǎo)出。具體實(shí)施方案如下:釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomycescerevisiae)經(jīng)PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)稀釋為16-1O7個(gè)/毫升，用微量注射泵以0.2 μ 1/min的流量從細(xì)胞懸浮液入口 2處進(jìn)樣，油相從連續(xù)油相入口 I以1.5 μ 1/min的流量進(jìn)樣，通過(guò)油相的剪切作用形成約50 μ m左右的油包水(W/0)液滴，同時(shí)側(cè)流油相從側(cè)流油相入口 3以1.2 μ Ι/min的流量進(jìn)樣用于引導(dǎo)液滴向廢液出口 5流向；通過(guò)顯微鏡觀察分選處的液滴包裹細(xì)胞的個(gè)數(shù)，當(dāng)包裹單個(gè)細(xì)胞時(shí)，觸動(dòng)電磁閥工作，進(jìn)而改變?cè)撘旱问芰瓦\(yùn)動(dòng)狀態(tài)，從而使目標(biāo)液滴從被分選液滴出口 6流向單液滴收集微管，至此，實(shí)現(xiàn)單液滴收集的目的，通過(guò)后續(xù)破乳化、提取等操作可獲取單個(gè)細(xì)胞。
[0041]實(shí)施例2:基于高速相機(jī)和圖像處理技術(shù)高效分離獲取單細(xì)胞
[0042]如圖1、2所示，本實(shí)例所構(gòu)建的基于高速相機(jī)和圖像處理方法高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)，微流控芯片7的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，其包括:1、連續(xù)油相入口 ；2、細(xì)胞懸浮液入口 ；3、側(cè)流油相入口 ；4、電磁閥連接口 ；5、廢液出口 ；6、被分選液滴出口。微流控芯片7由上層PDMS和下層玻璃基片鍵和而成，其中上層有25-150微米寬，40-60微米深的微通