素細胞的色素產(chǎn)生能力最好的細胞株挑選出來?；?者重復進行過程（1)至（3 )的篩選，反復進行2次以上也是可以的。通過這個操作，就能取 得本發(fā)明的細胞株。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的細胞株是細胞株RMD9。該細胞株 作為以保藏號CCTCC N0:C201408保藏。
[0033] 另外，本發(fā)明也涉及此類細胞株衍生的細胞。所謂"衍生"，是指以這類細胞株為起 源的意思。具體就是指使用遺傳因子導入技術將這類細胞株改變了的細胞，本發(fā)明也包括 從這類細胞株中被單獨分離的亞種細胞株。
[0034] 本發(fā)明的細胞株，主要是通過和黑色素細胞共培養(yǎng)從而更好的促進黑色素細胞的 色素生產(chǎn)能力。關于本發(fā)明的細胞株的序列，雖然不清楚，但可以肯定本發(fā)明的細胞株含有 有誘導作用的體液因素或者含有細胞黏附因子。不僅是作為滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)物，也可作為 細胞株和細胞培養(yǎng)基材的混合物，含有細胞株的細胞分散液等，含有本發(fā)明的細胞株的產(chǎn) 物是本發(fā)明的操作形態(tài)。另外，從細胞株中得到的培養(yǎng)懸液，以及細胞提取物也是本發(fā)明的 操作形態(tài)之一。
[0035] 因為本發(fā)明的細胞株能很好的促進黑色素細胞的色素生產(chǎn)能力，所以能夠很好的 還原皮膚的色素形態(tài)。例如，將含有黑色素細胞的細胞分散液接種到本發(fā)明的細胞株形成 的滋養(yǎng)層細胞上，培養(yǎng)后形成細胞培養(yǎng)組合物，將其移植到白癜風患者的患部，就能恢復正 常的色素形態(tài)。類似的細胞培養(yǎng)組合物的【具體實施方式】包括，將含有黑色素細胞的細胞分 散液接種到本發(fā)明的細胞株形成的滋養(yǎng)層細胞上，培養(yǎng)后形成的培養(yǎng)表皮都有成功案例。
[0036] 由本發(fā)明的細胞株形成的滋養(yǎng)層細胞物和含有黑色素細胞的細胞培養(yǎng)組合物的 制備方法沒有特別的規(guī)定，可以使用以下方法來很好的制作完成。
[0037] 從腰部，腹部，背部，臀部等，主要是從能被衣服所遮蓋的部位采集表皮組織。采集 的皮膚組織片在培養(yǎng)之前，先要用含有消化酶的培養(yǎng)液浸泡進行酶處理。作為比較合適的 消化酶，有胰蛋白酶，膠原酶，中性蛋白酶等。作為溶解消化酶的培養(yǎng)液，原代培養(yǎng)時也可以 使用無血清培養(yǎng)液。另外，例如Dulbecco' s MEM等也用的很好。
[0038] 本發(fā)明的細胞株形成的滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)物，當使用培養(yǎng)液將細胞株培養(yǎng)成80~ 100%的一體化后，使用絲裂霉素 C或X線照射等來抑制細胞增殖。培養(yǎng)細胞株的培養(yǎng)沒有 特別的規(guī)定，但使用含有10%牛胎兒血清的Dulbecco' sMEM等效果比較理想。
[0039] 在滋養(yǎng)層細胞上接種含有黑色素細胞以及表皮角質(zhì)細胞的細胞分散液，進行培 養(yǎng)。作為在培養(yǎng)時理想的培養(yǎng)液Ca2+的濃度，常規(guī)：0. 5~I. 9mM，理想：0. 8~I. 6mM，最理 想是I. 4mM濃度的KGM培養(yǎng)液。使用該培養(yǎng)液，制作出多層的皮狀細胞培養(yǎng)組合物通常需 要3~14天，理想天數(shù)在5~12天。
[0040] 在無血清培養(yǎng)液中也可以加入類似于EGF、FGF的激素或成長因子。另外，也可以 使用一些常用的細胞培養(yǎng)液，例如，除了上述的KGM培養(yǎng)液以外，還有DMEM (Dulbecco' s MEM)、RPMI1640、F-10、F-12、MEM、Dulbecco' s MEM+10%FBS 等。作為添加物，除了上述以 外，還可以加入氫化可的松，轉鐵蛋白，孕留酮，乙醇胺等。
[0041] 為了適用于廣泛的移植領域，從皮膚中提取的黑色素細胞和皮膚角質(zhì)細胞通過傳 代，盡可能多的培養(yǎng)比較好，但是，傳代過多的話，黑色素細胞的黑色素生產(chǎn)能力酒會下降， 以0-3代比較好。細胞傳代時，使用胰蛋白酶處理等通常的方法即可。
[0042] 當滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)物上的皮膚角質(zhì)細胞達到一體化后，通過再繼續(xù)培養(yǎng)3~7天， 就能長成多層細胞層的接近皮膚狀的培養(yǎng)物。
[0043] 細胞培養(yǎng)組合物根據(jù)上述方法大概需要花費10~30天，在14~21天之間效果 是最理想的。
[0044] 這樣的一個細胞培養(yǎng)組合物，通過目測就能了解黑色的程度。具體細節(jié)上，就需要 通過光學顯微鏡來觀察了解基礎的黑色素細胞和角質(zhì)細胞的數(shù)量比。表皮角質(zhì)細胞100 : 黑色素細胞數(shù)量在1~50之間為基礎，1~30為普通，2~20之間為理想，3~10之間為 完美。數(shù)量比可以通過光學顯微鏡來觀察測定，另外當培養(yǎng)組織物在消化酶處理的階段，一 體化或準一體化的時候也能測定。
[0045] 本發(fā)明的細胞培養(yǎng)組合物沒有規(guī)定動物的種類，但是白癜風治療時使用人來源比 較好。特別對于黑色素細胞和表皮角質(zhì)細胞最好是同一個人由來比較好，因為同一個人提 供自體的組織對于細胞培養(yǎng)組合物排異性低。
[0046] 本發(fā)明的細胞培養(yǎng)組合物中的黑色素細胞有多個的樹狀凸起，類似于人類身體環(huán) 境。該形態(tài)能通過DOPA染色等對黑色素細胞細胞培養(yǎng)組合物進行染色，然后用光學顯微鏡 觀察。據(jù)數(shù)據(jù)顯示，該形態(tài)的黑色素細胞的黑色素生產(chǎn)能力相當高。
[0047] 黑色素細胞細胞培養(yǎng)組合物這項研究雖然適用于局限性白癜風的治療，但也適用 于燒傷，過度曬傷，痔，刺青等的各類色素異常的治療。另外，不僅在醫(yī)療方面，在對黑色素 進行藥效評價的時候也適用美白效果等。比如：上述細胞培養(yǎng)組合物在培養(yǎng)的時候，在培養(yǎng) 液中添加各種藥物，從而對黑色素細胞的形成進行評價，從而達到篩選有抑制黑色素生長 作用的藥物等。
[0048] 附圖簡述
[0049] 圖1顯示了完成的黑色素細胞細胞培養(yǎng)組合物。其中，圖IA顯示了滋養(yǎng)層細胞 RMD9存在下的細胞形態(tài)，圖IB顯示了在Swiss3T3細胞存在下的細胞形態(tài)，其中，Swiss3T3 是市售獲得的細胞，例如可以 ATCC, CCL-92 從 http://www. atcc. org/Products/All/ CCL-92. aspxhttp://www. atcc. org/Products/All/CCL-92. aspx 購得。
[0050] 圖2顯示了黑色素細胞細胞培養(yǎng)組合物的顯微鏡觀察影像（圖2A)以及多巴 染色影像（圖2B)，其中箭頭所指的是黑色素細胞。采用的顯微鏡是OLYMPUS公司制造 1X51，DP26顯微攝影系統(tǒng)，焦距：X20倍。 具體實施方案
[0051] 以下是對于此項發(fā)明的表皮組織培養(yǎng)物以及用途和制造方法的實例展示以及具 體說明，但是本發(fā)明并不局限于此。
[0052] (1)RMD9細胞的選定
[0053] 小鼠皮膚片在10%FCS_DMEM (含有10%牛胎兒血清的Dulbecco's)中進行培養(yǎng)，培 養(yǎng)出成纖維細胞。將成纖維細胞進行30次以上的傳代培養(yǎng)，得到細胞株。用10%FCS-DMEM 對細胞株進行極限稀釋，接種于96孔的滴定板上，得到細胞株的克隆。將細胞株的克隆擴 大培養(yǎng)，接種在6孔培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至100% -體化。將從人皮膚組織取得的黑色素細胞接種到 滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)物上，培養(yǎng)10~30天后，目測黑色的程度。選擇黑色程度較好的細胞株， 選定RMD9。
[0054] ( 2 )滋養(yǎng)層細胞的制作
[0055] 將RMD9接種到培養(yǎng)皿中，使用10%FCS-DMEM將其培養(yǎng)到100% -體化。100% -體 化后，添加培養(yǎng)液將絲裂霉素 C調(diào)制成4 μ g/ml，培養(yǎng)1. 5~2個小時。將培養(yǎng)液去除，用 DMEM清洗2次，換成10%FCS-DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)1天。另外，使用3T3的小鼠細胞作為對照，調(diào) 制方法相同。
[0056] (3)皮膚樣品采集以及黑色素細胞細胞培養(yǎng)組合物的制作
[0057] 在患者腰部使用70%酒精棉球進行滅菌，從患者身體采集組織片。采集的組織片 浸泡在碘液中進行消毒，然后用PBS清洗。將組織片切碎，放入消化液中（消化液：TrypLE被 PBS5倍稀釋后）4°C環(huán)境下放置16~24個小時。常溫30分鐘攪拌，使用細胞株化過濾設 備將殘渣除去。形成的細胞懸液進行離心處理，回收細胞。然后關于殘渣的處理，使用膠原 蛋白酶（GIBC0公司）37°C環(huán)境3小時處理，然后進行細胞回收?；厥盏募毎ト龅?cm培 養(yǎng)皿中，使用KGM、放置于37°C 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10~20天，長滿后再培養(yǎng) 3~7天，細胞培養(yǎng)組合物培養(yǎng)完成（圖1)。作為對照，另外制作了一份沒有使用滋養(yǎng)層細 胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)物組成物。
[0058] (4)將黑色素細胞培養(yǎng)組合物進行DOPA染色。
[0059] 使用光學顯微鏡，觀察被DOPA染色的黑色素細胞的形狀，黑色素細胞和表皮角質(zhì) 細胞的數(shù)量以及堆積的細胞數(shù)(參見表1和圖1-2)。
[0060] 表 1
【主權項】
1. 一種促進黑色素細胞色素產(chǎn)生的細胞株，其特征在于，細胞株名稱為小鼠胚胎細胞 RMD9,保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：CCTCC NO :C201408。
2. -種細胞培養(yǎng)物，其包含如權利要求1所述的細胞株以及黑色素細胞。
3. 如權利要求2所述的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述黑色素細胞的生物來源選自：小 鼠、大鼠、豬、牛、猴子和人。
4. 如權利要求2所述的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述細胞株作為滋養(yǎng)層細胞，促進黑 色素細胞的色素產(chǎn)生。
5. -種培養(yǎng)懸液，其包含如權利要求1所述的細胞株。
6. -種培養(yǎng)懸液，其包含如權利要求1所述的細胞株的提取物。
7. 如權利要求1所述的細胞株的制備方法，所述方法包括以下步驟： a. 取小鼠皮膚片，進行細胞株的克隆過程； b. 將上述克隆的細胞株與黑色素細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)過程； c. 評價黑色素細胞的色素生產(chǎn)能力，選定能夠促進黑色素細胞色素產(chǎn)生的細胞株。
8. 如權利要求2-4中任一項所述的細胞培養(yǎng)物在進行皮膚美容產(chǎn)品篩選中的應用。
9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述皮膚美容產(chǎn)品包括：美白產(chǎn)品、白癜風 治療產(chǎn)品、過度曬傷治療產(chǎn)品、燒傷治療產(chǎn)品、大面積黑痣治療產(chǎn)品、疤痕治療產(chǎn)品、痤瘡治 療產(chǎn)品和紋身治療產(chǎn)品。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種促進黑色素細胞色素產(chǎn)生的細胞株，稱為小鼠胚胎細胞RMD9，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO：C201408。本發(fā)明還涉及包含該細胞株的細胞培養(yǎng)物以及培養(yǎng)懸液。本發(fā)明還描述了小鼠胚胎細胞RMD9的制備方法及其在皮膚美容產(chǎn)品篩選中的應用。CCTCC NO: C20140820140107
【IPC分類】C12Q1-02, C12N5-071, C12N5-073
【公開號】CN104877957
【申請?zhí)枴緾N201410072272
【發(fā)明人】宇山太郎, 吳復躍, 何振東
【申請人】上海尚瑞生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2014年2月28日