一種成年豚鼠心肌分離細胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種成年豚鼠心肌分離細胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]用動物胚胎和新生心肌細胞來培養(yǎng)心肌細胞的方法已廣泛研宄，然而，胚胎細胞與成人細胞不同，研宄發(fā)現(xiàn)在胚胎和新生兒心肌細胞中離子通道特性及分布和收縮蛋白亞型表達的變化不同于成人心肌細胞，二者之中的動作電位也相差甚遠。急性分離的心肌細胞及胚胎心肌細胞的培養(yǎng)已被廣泛應用30多年，為醫(yī)學研宄及新藥研發(fā)做出了重要貢獻，但是隨著近年來分子生物學技術(shù)，心臟生理學的不斷發(fā)展及完善，急性分離的心肌細胞越來越不能滿足目前的研宄要求。因此成年動物心肌細胞培養(yǎng)將成為越來越重要的技術(shù)，可以廣泛應用心臟病動物模型，藥物篩選及心律失常的機理研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明提供一種成年豚鼠心肌分離細胞的培養(yǎng)方法，該方法使用方便且培養(yǎng)的心肌細胞成活率高并具有極好的穩(wěn)定性。
[0004]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種成年豚鼠心肌分離細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:(1)急性細胞分離:(a)將成年豚鼠麻醉后快速取出心臟放置于4 C0含鈣液中去除心包，找出主動脈然后掛于灌注裝置上開始心臟逆向灌注，先用含鈣液灌流2min，然后用無鈣EGTA液灌流5min，再用酶解液循環(huán)灌流8_10min，再用酶洗脫液灌流5min ； (b)剪下心室肌組織放入無菌培養(yǎng)皿并切碎，(c)將切碎的心室肌組織加入酶洗脫液中，在37° C下用自動搖晃機進行機械性分離5-10min得到細胞懸浮液(d)將細胞懸浮液用200目的尼龍紗布過濾，所得濾液中的心室肌細胞準備下一步培養(yǎng)；其中，所述含鈣液為:300ml灌流母液中加入0&(:12至Ca 2+濃度為750 ymol/L ;所述無鈣EGTA液為:300ml灌流母液中加入EGTA至EGTA濃度為3.3 ymol/L ;所述酶解液為:80ml灌流母液中加入CaCl2、粗膠原酶和蛋白酶，使Ca2+濃度為100 μπιοΙ/L、粗膠原酶濃度為lmg/ml、蛋白酶的濃度為0.1 mg/ml ;所述酶洗脫液為:220ml灌流母液中加入0&(:12至Ca 2+濃度為100 ymol/L ;所述灌流母液用超純水配制，其中含有:130 mmol/L NaCl, 23 mmol/ L 4-輕乙基呢嘆乙磺酸，21 mmol/L葡萄糖，20 mmol /I,牛橫酸，5 mmol /I,肌酸，5 mmol /T, MgCl2, 5 mmol/L 丙酬酸納，4.5 mmol/L KC1，1 mmol/L NaH2PO4, pH 為 7.3 ;
(2)鋪細胞:取步驟(I)得到的心室肌細胞離心后放入培養(yǎng)基中，用細胞計數(shù)器計算出心肌細胞密度，鋪在培養(yǎng)皿上的細胞密度應控制小于14個正常桿狀細胞/ cm-2；
(3)更換培養(yǎng)液:在細胞鋪后4小時之內(nèi)每隔30min慢慢更換培養(yǎng)液，取出死細胞，4小時之后，每3天換一次培養(yǎng)液。
[0005]步驟(2)所述培養(yǎng)基包括碳酸氫鹽緩沖液和通用添加劑，所述碳酸氫鹽緩沖液含有 1.8mmol/L CaCl2,116 mmol /T, NaCl, 0.6 mmol /I,醋酸納，I mmol /T, NaHPO4, 5.3mmol/LKCl, 0.8 mmol/L MgSO4JZf述通用添加劑包括 5 mmol/L 肌酸，5mmol/L 牛磺酸，2mmol/L 左旋肉堿，2.5 mmol/L丙酮酸，10—7 mmol/L胰島素和胞啼啶-β-D-呋喃阿拉伯糖苷，胞啼啶-β -D-呋喃阿拉伯糖苷的最終體積濃度是1%。
[0006]步驟(2)所述培養(yǎng)皿用層粘連蛋白液覆蓋于表面至少30分鐘，所述層粘連蛋白液用磷酸鹽緩沖液稀釋至終濃度為1- 5 μ g /ml。
[0007]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:該方法使用方便且培養(yǎng)的心肌細胞成活率高并具有極好的穩(wěn)定性，減小了非心肌細胞的過度生長和可能產(chǎn)生的細菌污染，為心臟病研宄及新藥研發(fā)提供了一個重要手段。
【附圖說明】
[0008]圖1是灌流裝置示意圖；
圖2是培養(yǎng)至第五天的豚鼠心肌細胞照片；
圖3是用全細胞電壓鉗記錄培養(yǎng)至第五天的心肌細胞上內(nèi)向整流鉀電流Iki;
圖4是用全細胞電壓鉗記錄培養(yǎng)至第五天的心肌細胞上L型鈣電流Ica^
圖5是全細胞電壓鉗記錄培養(yǎng)至第五天的心肌細胞上快速鈉通道電流INa。
【具體實施方式】
[0009]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。
[0010]本發(fā)明采用的心肌分離細胞的灌注裝置:如圖1所示，該裝置包括三個雙層可預熱的300毫升容量的玻璃罐1、6和7，變速蠕動泵2、加熱套管3和循環(huán)桶4，玻璃罐儲有灌流心臟所需要的溶液:750 ymol/L的含鈣液(玻璃罐7)、無鈣EGTA液(玻璃罐6)和酶解液(玻璃罐1)，灌流溫度設(shè)置在36.5±0.5 C0，裝置中安有開關(guān)5，有效阻止氣泡進入系統(tǒng)而阻斷冠狀動脈循環(huán)。將取出的心臟系在套管3上，溶液流動由變速蠕動泵2帶動。
[0011]本發(fā)明的成年豚鼠心肌分離細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:(1)急性細胞分離:Ca)將成年豚鼠麻醉后快速取出心臟放置于4 C0 750 ymol/L的含鈣液中小心去除心包，輕輕擠壓心臟擠出殘留于心臟的淤血，找出主動脈然后系在套管3上開始心臟逆向灌注，先用含鈣液灌流2min，然后用無鈣EGTA液灌流5min，再用酶解液循環(huán)灌流8_10min，再用酶洗脫液灌流5min ;(b)剪下心室肌組織放入無菌培養(yǎng)皿，再用小剪刀切碎心室組織，(c)將切碎的心室肌組織加入到含有50毫升100 ymol/L Ca2+溶液的搖瓶中，在37° C下用自動搖晃機進行機械性分離5-10min得到細胞懸浮液，(d)將細胞懸浮液用200目(0.45微米)的尼龍紗布過濾，所得濾液中的心室肌細胞準備下一步培養(yǎng)；其中，所述含鈣液為:300ml灌流母液中加入0&(:12至Ca 2+濃度為750 ymol/L ;所述無鈣EGTA液為:300ml灌流母液中加入EGTA至EGTA濃度為3.3 μ mo I/L ;所述酶解液為:80ml灌流母液中加入CaCl2、粗膠原酶和蛋白酶，使Ca2+濃度為100 ymol/L、粗膠原酶濃度為lmg/ml、蛋白酶的濃度為0.1mg/ml ;所述酶洗脫液為:220ml灌流母液中加入0&(:12至Ca 2+濃度為100 ymol/L ;所述灌流母液用超純水配制，其中含有:130 mmol/L NaCl, 23 mmol/ L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，21mmol /I,葡萄糖，20 mmol /I,牛橫酸，5 mmol /I,肌酸，5 mmol /T, MgCl2, 5 mmol /I,丙酬酸納4.5 mmol/L KCl, I mmol/L NaH2PO4, pH為7.3。灌流母液需要用孔徑為0.2 μ m的過濾器(用濾紙加針筒)過濾來去除微生物和微粒。
[0012](2)鋪細胞:取適量步驟(I)得到心室肌細胞離心后放