Hiv-1 crf_bc重組毒株的非cd4受體利用的假病毒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中Hiv-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] HIV-I病毒包膜蛋白是由env基因（gpl60)編碼出的850-880個氨基酸組成的糖 蛋白。在gpl60中有一段富含精氨酸的疏水區(qū)，在此位點可被宿主蛋白酶裂解成為2個亞 基，即gpl20和gp41。HIV-I病毒包膜蛋白gpl20上的⑶4受體結(jié)合區(qū)首先與靶細胞上的 ⑶4受體結(jié)合，完成HIV-I病毒入侵的第一步。隨后包膜蛋白gpl20上輔助受體結(jié)合區(qū)與靶 細胞上的輔助受體（CCR5和/或CXCR4)結(jié)合，完成病毒入侵的第二步。最后HIV-I病毒包 膜蛋白gp41介導(dǎo)病毒包膜與靶細胞質(zhì)膜融合，完成病毒感染入侵過程。根據(jù)HIV-I病毒感 染入侵過程，包膜蛋白的CD4受體結(jié)合區(qū)、輔助受體結(jié)合區(qū)和gp41均是HIV-I病毒重要的 結(jié)構(gòu)區(qū)域。
[0003] ⑶4受體在HIV-I病毒感染入侵過程中發(fā)揮著重要作用，是HIV-I病毒感染入侵的 重要受體之一。但是科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)存在非⑶4受體利用的HIV-I病毒（⑶4-ind印endent HIV-1)，雖然非⑶4受體利用病毒只是HIV-I病毒中的極少部分，但是文獻報道這些非⑶4 受體利用病毒對中和抗體的敏感性增高，其在中和敏感性方面與CD4受體利用病毒的中和 敏感性不同。非CD4受體利用的HIV-I病毒可以模擬HIV-I病毒感染入侵過程中的后兩個 過程，從而可能會有助于了解HIV-I病毒包膜蛋白的結(jié)構(gòu)。
[0004] 雖然國外報道存在非CD4受體利用的HIV-I病毒（CD4-ind印endent HIV-DdS 是在中國關(guān)于非CD4受體利用的HIV-I病毒尚未見報道。與歐美國家主要流行HIV-I B亞 型毒株，非洲國家主要流行HIV-I C亞型毒株不同，我國主要的HIV流行毒株經(jīng)歷了 HIV-I 亞型和HIV-I C亞型的傳入，HIV-I 亞型和HIV-I C亞型的重組，到V亞型演變 為V /C重組亞型（占50. 20% )的過程（孫偉等· HIV-I /C亞型毒株的復(fù)制動力學(xué) 特點·傳染病信息，2010,23(6):340-342·)。其中，HIV-I /C 亞型毒株（HIV-1 /C recombinant subtype，HIV-I IV /C重組亞型毒株，）主要分布在我國西北地區(qū)如新疆等 地（GUO Yan-fang，MA Li-ying, YUAN Lin, et al. R5 to X4coreceptor switch of human immunodeficiency virus type I B'and B'/Crecombinant subtype isolates in China. Chin Med J. 2007, 120 (6): 522-525)。一些HIV-I各亞型間的重組類型已經(jīng)在全球廣泛 流行，這些重組病毒被命名為流行性重組型（circulating recombinant forms，CRFs)病 毒，己經(jīng)報道有13個CRFs (除去CRF09,其序列和重組結(jié)構(gòu)仍未知）。宋艷輝用美國NCBI (http:/www. ncbi. nlm. nih. gov/projects)網(wǎng)站提供的亞型分析工具對來源于四川西昌和 新疆烏魯木齊、伊犁地區(qū)靜脈吸毒人群（IDUs)的樣本的HIV-I毒株的基因型進行初步判定 后，通過MEGA3. 1軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹進行確認，來源于上述地區(qū)IDUs 的HIV-I毒株均為CRF07_BC重組毒株，未發(fā)現(xiàn)有CRF08_BC重組毒株（宋艷輝.我國HIV-I 主要流行地區(qū)B'亞型與CRF07_BC重組毒株遺傳變異分析.中國科學(xué)院研宄生院博士學(xué) 位論文.2007)。與CRF_BC重組毒株相關(guān)的病毒學(xué)特性也具有其獨特的特點，比如CRF_BC 重組毒株主要利用CCR5輔助受體，尚未發(fā)現(xiàn)利用CXCR4輔助受體的CRF_BC重組毒株。在 中和抗體的敏感性方面，國外報道的具有高度抗HIV-I活性的人源單克隆抗體（如2G12、 IgGlbl2、2F5和4E10)，在面對中國流行的HIV-I毒株時也表現(xiàn)出不同的中和活性，一項包 括18個BC毒株、6個B毒株和3個AE毒株對2G12、IgGlbl2、2F5和4E10單克隆抗體敏感 性的研宄中，發(fā)現(xiàn)2G12、IgGlbl2和2F5單克隆抗體只對部分BC毒株、B毒株和AE毒株有中 和作用，而4E10單克隆抗體則對18個BC毒株、6個B毒株和3個AE毒株表現(xiàn)出較好的中 和作用(Chong, H. , K. Hong, C. Zhang, et al. Genetic and Neutralization Properties of HIV-I env Clones From Subtype B/BC/AE Infections in China. J Acquir Immune Defic Syndr. 2008, 47(5) :535-543)。最近報道的中和活性高的VRCOl抗體，在對11株CRF07_BC 重組毒株進行抗病毒活性檢測后，其平均IC5tl值在1. 25 μ g/mL，遠遠高于其它亞型的IC5tl 值（總 1〇5(|值均值在 0· 37 μ g/mL) (Wu, X.，Z. Y. Yang, Y. Li, et al. Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1. Science. 2010, 329(5993) :856-61)。這些研宄表明我國流行的CRF_BC重組毒株不僅在生 物學(xué)方面與其它亞型存在差異，在中和抗體的敏感性方面與其它亞型也存在差異，其機制 目前尚不清楚，因此有必要針對CRF_BC重組毒株的包膜蛋白進行深入研宄。
[0005] 假病毒是一種病毒的核酸由另一種病毒編碼的包膜蛋白所包被，從而形成的具有 外源性病毒囊膜，而基因組保持著逆轉(zhuǎn)錄病毒本身基因組特征的病毒。通常是將攜帶某一 種病毒囊膜蛋白基因的載體和攜帶另一種病毒核衣殼骨架基因的載體共轉(zhuǎn)染包裝細胞，在 包裝細胞的細胞膜上表達出病毒囊膜蛋白，另一種病毒的核酸在包裝細胞內(nèi)通過轉(zhuǎn)錄和翻 譯后組裝成新的病毒顆粒，當(dāng)病毒顆粒進行出芽生殖時，包裝細胞膜上的囊膜蛋白就包裝 到新病毒粒子表面，形成有浸染性的假病毒。與自然源性病毒相比，假病毒整合了其它病毒 的囊膜蛋白，而且核酸分子上編碼囊膜蛋白的基因被修飾掉，所以這種病毒喪失了病毒的 自我復(fù)制能力，只能進行一個細胞周期的侵染；與具有感染性的活病毒相比，利用假病毒進 行試驗研宄安全性較高。假病毒模式已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于包括人免疫缺陷病毒（HIV)在內(nèi)的 多種研宄中（王艷海等.HIV-I假病毒的研宄進展.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志.2012年第44卷第 7期）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何制備非CD4受體利用的HIV-I假病毒（如 HIV-1CRF_BC重組毒株的假病毒）。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了 HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利 用的假病毒。
[0008] 本發(fā)明所提供的HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒，為假病毒A 或假病毒B ;所述假病毒A含有包膜蛋白A，所述包膜蛋白A為下述Al)或A2)的蛋白質(zhì)：
[0009] Al)氨基酸序列為SEQ ID No. 1的蛋白質(zhì)；
[0010] A2)在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或 幾個氨基酸殘基得到的具有所述包膜蛋白A功能的由Al)衍生的蛋白質(zhì)；
[0011] 所述假病毒B含有包膜蛋白B，所述包膜蛋白B為下述BI)或B2)的蛋白質(zhì)：
[0012] BI)氨基酸序列為SEQ ID No. 2的蛋白質(zhì)；
[0013] B2)在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或 幾個氨基酸殘基得到的具有所述包膜蛋白B功能的由BI)衍生的蛋白質(zhì)。
[0014] 上述HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒為正鏈RNA病毒。
[0015] 上述HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒中，所述假病毒A是將 HIV-I骨架載體與表達所述包膜蛋白A的重組載體共轉(zhuǎn)染包裝細胞，包裝得到的假病毒；所 述假病毒B是將HIV-I骨架載體與表達所述包膜蛋白B的重組載體共轉(zhuǎn)染包裝細胞，包裝 得到的假病毒。
[0016] 上述HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒中，所述包裝細胞為哺乳 動物細胞，具體可為 293T細胞、C0S7細胞、MDCK細胞、VER0細胞、WI-38、HL-8、HeLa細胞和 Chang C/I/L/K細胞中的一種或兩種以上。
[0017] 上述HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒中，表達所述包膜蛋白A 的重組載體可在所述包裝細胞中表達所述包膜蛋白A，表達所述包膜蛋白A的重組載體可 含有SEQ ID No. 3所示的包膜蛋白A的編碼基因；表達所述包膜蛋白B的重組載體可在所 述包裝細胞中表達所述包膜蛋白B，表達所述包膜蛋白B的重組載體可含有SEQ ID No. 4所 示的包膜蛋白B的編碼基因。
[0018] 上述HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒中，所述含有 SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列的重組載體具體可為pcDNA3. 1-CH120N197S，所述 pcDNA3. 1-CH120N197S為將SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列通過TA克隆入表達載 體pcDNA?3. 1/V5-His- Τ0Ρ0?，得到表達氨基酸序列為SEQ ID No. 1的所述包膜蛋 白A的重組載體；所述含有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列的重組載體具體可為 pcDNA3. 1-CH110N197S，為將SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列通過TA克隆入表達載體 pcDNA?3. l/V5-His-T0P0?，得到表達氨基酸序列為SEQ ID No. 2的所述包膜蛋白B的重組 載體。
[0019] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受 體利用的假病毒相關(guān)的生物材料。
[0020] 本發(fā)明所提供的與所述Hiv-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒相關(guān) 的生物材料，為下述Cl)至C3)中的任一種：
[0021] Cl)含有所述HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒的動物細胞系；
[0022] C2)含有所述HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒的動物組織；
[0023] C3)含有所述HIV-I CRF_BC重組毒株的非⑶4受體利用的假病毒的動物器官。
[0024]