-PCR引物對，所述引物對的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :2所 示，g卩：5' -AATTTGGGTCACTCCCTTCTAC-3'，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，即： 5' -GTGAGTTCCTTGCTCTCTGTTG-3'。
[0011] 本發(fā)明還提供一種用于檢測胃癌細(xì)胞和組織及結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織的試劑盒，其 特征在于：該試劑盒含有上述引物對。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還可以含有內(nèi)參GAPDH的半定量RT-PCR引物，該內(nèi)參 GAPDH的半定量RT-PCR引物可以為本領(lǐng)域常用的引物，例如其上游引物可以核苷酸序列如 SEQ ID N0:4所示，即：5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物核苷酸序列可以如SEQ ID NO :5 所示，SP :5' -GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
[0013] 該試劑盒還可以含有長鏈非編碼RNA高表達(dá)細(xì)胞系BGC823提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄 并稀釋的cDNA，作為檢測上述引物對的可行性的陽性模板。
[0014] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還可以含有RT-PCR反應(yīng)所需的下列成分：5 X PCR buffer，IOmM dNTPs，Hot start Taq 酶，ddH20〇
[0015] 本發(fā)明還提供一種用于檢測胃癌和結(jié)直腸癌的RT-PCR反應(yīng)體系，以總體積25ul 計，其包括：
[0016] (1)模板：2. 5ul ;
[0017] (2)濃度為IOuM的上述引物對以及內(nèi)參GAPDH的半定量RT-PCR引物，其中，上游 引物與下游引物各Iul ;
[0018] (3) 5 X PCR buffer ：5ul ；
[0019] (4)IOmM dNTPs:0. 5ul ；
[0020] (5)Hot start Taq 酶：0· 25ul ;
[0021] (6)ddH20:14. 75ul〇
[0022] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：利用本發(fā)明所述引物對及試劑盒檢測胃癌組織和癌旁組 織，與癌旁組織相比在胃癌組織中Lnc21q22. 11表達(dá)降低80% (28/35)，表明該IncRNA在 胃癌中低表達(dá)，是胃癌中潛在的抑癌基因，可作為胃癌的新的分子標(biāo)志；同時利用本發(fā)明 所述引物對及試劑盒檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁組織，與癌旁組織相比在結(jié)直腸癌組織中 Lnc21q22. 11表達(dá)降低70% (7/10)，表明該IncRNA在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，是結(jié)直腸癌中潛 在的抑癌基因，可作為結(jié)直腸癌的新的分子標(biāo)志。本試劑盒首次選用Lnc21q22. 11作為檢 測標(biāo)志物，該IncRNA是本發(fā)明人首次在胃癌和結(jié)直腸癌中篩選出的在胃癌組織和結(jié)直腸 癌中表達(dá)下降的IncRNA，具有首創(chuàng)性。因此，應(yīng)用本發(fā)明提供的引物對及試劑盒來檢測胃癌 或結(jié)直腸癌Lnc21q22. 11的表達(dá)水平可作為胃癌或結(jié)直腸癌診斷、療效觀察、預(yù)后判斷、殘 留病灶及復(fù)發(fā)檢測等的有力手段，而且，操作簡便，穩(wěn)定性好，靈敏度高，具有深遠(yuǎn)的臨床意 義和推廣性。
【附圖說明】
[0023] 圖1應(yīng)用上述Lnc21q22. 11半定量RT-PCR引物對在10株胃癌細(xì)胞系中 Lnc21q22. 11的表達(dá)水平檢測，GAPDH為內(nèi)參，CldH2O為體系對照，用以評估體系是否存在 PCR產(chǎn)物的污染，如CldH2O檢測的結(jié)果為陰性，則體系結(jié)果可信，本體系擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 587bp〇
[0024] 圖2在5對配對的胃癌及癌旁組織中應(yīng)用上述Lnc21q22. 11半定量RT-PCR引物 對檢測Lnc21q22. 11的表達(dá)水平，GAPDH為內(nèi)參，CldH2O為體系對照，用以評估體系是否存 在PCR產(chǎn)物的污染，如CldH 2O檢測的結(jié)果為陰性，則體系結(jié)果可信，本體系擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 587bp〇
[0025] 圖3在10株結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，應(yīng)用上述Lnc21q22. 11半定量RT-PCR引物對在 10株胃癌細(xì)胞系中Lnc21q22. 11的表達(dá)水平檢測，GAPDH為內(nèi)參，CldH2O為體系對照，用以 評估體系是否存在PCR產(chǎn)物的污染，如CldH 2O檢測的結(jié)果為陰性，則體系結(jié)果可信，本體系 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為587bp。
[0026] 圖4在5對配對的結(jié)直腸癌及癌旁組織中應(yīng)用上述Lnc21q22. 11半定量RT-PCR 引物對檢測Lnc21q22. 11的表達(dá)水平，GAPDH為內(nèi)參，CldH2O為體系對照，用以評估體系是否 存在PCR產(chǎn)物的污染，如CldH2O檢測的結(jié)果為陰性，則體系結(jié)果可信，本體系擴(kuò)增產(chǎn)物大小 為 587bp。
[0027] 圖5將Lnc21q22. 11高表達(dá)的胃癌細(xì)胞系BGC823的cDNA與CldH2O按比例混合， 應(yīng)用上述Lnc21q22. 11半定量RT-PCR引物對檢測Lnc21q22. 11的表達(dá)水平，擴(kuò)增條帶如圖 所示。BGC823細(xì)胞cDNA含量依次為100%，50%，5%，1%，0· 5%，0%。CldH2O為體系對照， 用以評估體系是否存在PCR產(chǎn)物的污染，如CldH2O檢測的結(jié)果為陰性，則體系結(jié)果可信，本 體系擴(kuò)增產(chǎn)物大小為587bp。
【具體實施方式】
[0028] 為更詳細(xì)地了解本發(fā)明，以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0029] 實施例一
[0030] 1、模板的制備（總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄過程）
[0031] RNA的制備：獲取胃癌組織樣本及對應(yīng)的癌旁組織樣本以及結(jié)直腸癌組織樣本和 對應(yīng)的癌旁組織樣本，在本實施例中各取5個胃癌組織樣本GCl~GC5, 5個與胃癌組織配 對的癌旁組織樣本GNl~GN5,以及在本實施例中各取5個結(jié)直腸癌組織樣本CRCl~CRC5， 5個與結(jié)直腸癌組織配對的癌旁組織樣本CNl~CN5。
[0032] 應(yīng)用TRIZOL抽提的方法分別對上述樣本進(jìn)行總RNA的提取，紫外分光光度儀測定 吸光度（A)值確定其含量及純度，1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。
[0033] cDNA合成：將上述胃癌組織及對應(yīng)的癌旁組織中和結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)的癌 旁組織所提取的總 RNA5ug 應(yīng)用 SuperscriptIII-reversetranscriptasekit (Invitrog en)中的隨即引物逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，所得cDNA用加去離子水稀釋至lOOul，取其中的 2. 5ulcDNA用于25ul體系半定量RT-PCR。
[0034] 2、半定量 RT-PCR
[0035] 以Lnc21q22. 11半定量RT-PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系，以總體積25ul計， 包括：
[0036] (1)模板（cDNA) :2. 5ul ;
[0037] (2)濃度為IOuM的所述引物對，其中，上游引物與下游引物各Iul ;
[0038] 上游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :2 所示，即：5' -AATTTGGGTCACTCCCTTCTAC-3'： Iul,
[0039] 下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :3 所示，g卩：5' -GTGAGTTCCTTGCTCTCTGTTG-3'： Iul ；
[0040] (3) 5 X PCR buffer ：5ul ；
[0041] (4) IOmM dNTPs:0. 5ul ；
[0042] (5)Hot start Taq 酶：0· 25ul ;
[0043] (6)ddH20:14. 75ul〇
[0044] 擴(kuò)增條件：
[0045] Lnc21q22. 11采用St印down PCR條件擴(kuò)增，條件如下：
[0046] 95 〇C 5min
[0047] 95°C 30s - 64°C 30s - 72°C 60s，3 個循環(huán)；
[0048] 95°C 30s - 61°C 30s - 72°C 60s，3 個循環(huán)；
[0049] 95°C 30s - 58°C 30s - 72°C 60s，3 個循環(huán)；
[0050] 95°C 30s - 55°C 30s - 72°C 60s，26 個循環(huán)；
[0051] 72 °C 5min.
[0052] 產(chǎn)物大?。?87bp
[0053] 內(nèi)參GAPDH的半定量RT-PCR 25ul體系包括：
[0054] (1)模板：2. 5ul ;
[0055] (2)半定量 RT-PCR 引物（lOpmol/ul):
[0056] 上游引物核苷酸序列如 SEQ ID N0:4 所示，g卩：5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3' ： Iul,
[0057] 下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :5 所示，即：5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' ： Iul ；
[0058] (3) 5 X PCR buffer ：5ul ；
[0059] (4)IOmM dNTPs:0. 5ul ；
[0060] (5)Hot start Taq 酶：0· 25ul ;
[0061] (6)ddH20:14. 75ul〇
[0062] 產(chǎn)物大?。?54bp
[0063] 擴(kuò)增條件為：
[0064] 反應(yīng)條件：95°C 5min ;95°C 30s - 63°C 30s - 72°C 45s，25 個循環(huán)；75°C 5min，產(chǎn) 物大?。?54bp。
[0065] 3. PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測
[0066] PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射分析儀檢測并照相。
[0067] 4.結(jié)果
[0068] 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物條帶強(qiáng)弱判斷胃癌組織及配對癌旁組織中和結(jié)直 腸癌組織及配對癌旁組織中Lnc21q22. 11的表達(dá)量。在5對胃癌組織和配對癌旁組織中， 胃癌組織中Lnc21q22. 11的表達(dá)量低于配對癌旁組織（圖2)在5對結(jié)直腸癌組織和配對 癌旁組織中，其中3對結(jié)直腸癌中Lnc21q22. 11的表達(dá)量低于配對癌旁組織。其中GC為胃 癌組織，GN為配對的胃癌癌旁組織，CRC為結(jié)直腸癌組織，CN為配對的結(jié)直腸癌癌旁組織， GAPDH為內(nèi)參，CldH2O為體系對照，用以評估體系是否存在PCR產(chǎn)物的污染，如CldH2O檢測的 結(jié)果為陰性，則體系結(jié)果可信，本體系擴(kuò)增產(chǎn)物大小為587bp。
[0069] 實施例二：臨床標(biāo)本檢測
[0070] (1)取35對配對的胃癌組織和癌旁組織，進(jìn)行Lnc21q22. 11的半定量RT-PCR擴(kuò) 增，模板制備、PCR擴(kuò)增體系及條件、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測均與實施一中的相同，檢測結(jié)果（表達(dá) 水平為互相配對的胃癌組織與癌旁組織相比的相對水平）請見下表1 :
[0071] 表 1
[0072]
【主權(quán)項】
1. 一種長鏈非編碼RNA分子，其堿基序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -種引物對，其特征在于，用于檢測細(xì)胞和組織中的如權(quán)利要求1所述的長 鏈非編碼RNA表達(dá)水平，該引物對的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，即： 5' -AAITTGGGTCACTCCCTTCTAC-3'，下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :3 所示，即： 5' -GTGAGTTCCTTGCTCTCTGTTG-3'。
3. -種檢測胃癌和結(jié)直腸癌的試劑盒，其特征在于：含有權(quán)利要求2所述的引物對。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：還含有內(nèi)參GAPDH的半定量RT-PCR引 物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，即：5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游 引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :5 所示，即：5' -GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于：還含有長鏈非編碼RNA高表達(dá)細(xì) 胞系BGC823提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄并稀釋的cDNA，作為檢測權(quán)利要求2中所述的引物對的可 行性的陽性模板。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于：還含有RT-PCR反應(yīng)所需的下列成 分：5 XPCR buffer, IOmM dNTPs, Hot start Taq 酶，ddH20。
7. -種用于檢測胃癌和結(jié)直腸癌的RT-PCR反應(yīng)體系，以總體積25ul計，其包括： (1) 模板：2. 5ul ; (2) 濃度為IOuM的權(quán)利要求2所述的引物對以及權(quán)利要求4中所述的內(nèi)參GAPDH的半 定量RT-PCR引物，其中，上游引物與下游引物各Iul ; (3) 5XPCR buffer ：5ul ； (4) IOmM dNTPs:0. 5ul ； (5) Hot start Taq 酶：0? 25ul ; (6) ddH20:14. 75ul〇
【專利摘要】本發(fā)明提供新的長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)Lnc21q22.11序列、檢測細(xì)胞和組織中的該長鏈非編碼RNA表達(dá)水平的引物對及試劑盒。本發(fā)明首次鑒定出LncRNALnc21q22.11全長共1202bp，并應(yīng)用特異性引物通過半定量RT-PCR首次在胃癌細(xì)胞及35對胃癌系及癌旁組織中以及結(jié)直腸癌細(xì)胞系和10對結(jié)直腸癌及癌旁組織中檢測LncRNALnc21q22.11的表達(dá)水平，具有首創(chuàng)性。利用本發(fā)明所述試劑盒及特異性引物對胃癌組織中LncRNALnc21q22.11的表達(dá)的檢測可作為胃癌及結(jié)直腸癌診斷、療效觀察、預(yù)后判斷、病灶殘留以及復(fù)發(fā)檢測等的有效手段，而且操作簡便、穩(wěn)定性好、靈敏度高，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104877998
【申請?zhí)枴緾N201510242287
【發(fā)明人】郭明洲, 曹寶平, 張美英, 令狐恩強(qiáng), 楊帥, 金永帥
【申請人】中國人民解放軍總醫(yī)院
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月13日