高通量的多年生黑麥草農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系及其專用試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高通量獲得多年生黑麥草農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的 試劑盒和轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多年生黑麥草（Lolium perenne L.)是世界上最重要的溫帶牧草之一（Jauhar 1993)，僅新西蘭的種植面積就已超過700多萬公頃（Siegal et al. 1985)。同時多年生黑 麥草又是一種異型雜交、風(fēng)媒和高度自交不親和的物種（Thorogood et al. 2002)。因其高 度自交不親和性使得傳統(tǒng)雜交育種在黑麥草優(yōu)良品種的培育面前顯得無計可施。而迅速崛 起的生物技術(shù)育種度身定造般的彌補(bǔ)了此類空缺。通過高通量的農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)獲得多年 生黑麥草優(yōu)良品種，對于改善動物的營養(yǎng)均衡、提高牛奶的產(chǎn)量和品質(zhì)、增大乳品行業(yè)的利 益，乃至改良人工草坪、防風(fēng)固沙、保持水土、改善人類生存環(huán)境等都具有舉足輕重的作用。
[0003] 與其他單子葉植物相似，黑麥草屬不是農(nóng)桿菌的天然宿主。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法比其 他物理轟擊法能更高效地獲得了具備低拷貝、完整引入、穩(wěn)定表達(dá)特性的轉(zhuǎn)基因植株（Luo et al. 2003 ;Han et al. 2005)。到目前為止有關(guān)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化多年生黑麥草的成功案例少之 又少（Bettany et al. 2003 ;Wu et al. 2005 ;Bajaj et al. 2006 ;Zhang et al. 2012)。隨著 其他單子葉植物轉(zhuǎn)化體系的突破，篩選組培效應(yīng)敏感的基因型、優(yōu)化培養(yǎng)基配方、簡化轉(zhuǎn)化 流程，以期獲得高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為甄別影響產(chǎn)業(yè)性狀的目標(biāo)基因奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中無法用農(nóng)桿菌對多年生黑麥草進(jìn)行轉(zhuǎn)化的缺陷，本發(fā)明提供一 種多年生黑麥草農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的試劑盒和轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的第一個目的為提供一種多年生 黑麥草農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的試劑盒，其具體組成如下：
[0005] 本發(fā)明所述試劑盒依次包括發(fā)芽培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基I、誘導(dǎo)培養(yǎng)基II、分化培養(yǎng) 基、保持培養(yǎng)基、侵染液、共培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基I、篩選培養(yǎng)基Π 、再生培養(yǎng)基和生根培養(yǎng) 基；
[0006] 所述發(fā)芽培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為 30g/L的蔗糖和3g/L凝固劑；
[0007] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為 22. 6 μΜ的2, 4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固劑；
[0008] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為 9 μ M的2, 4-二氯苯氧乙酸、0· 44 μ M的6-芐氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和3g/L的凝固劑 ;
[0009] 所述分化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為 4. 4 μ M的6-節(jié)氨基腺嗓呤、30g/L麥芽糖和3g/L的凝固劑 ;
[0010] 所述保持培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為 8. 8 μ M的6-芐氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固劑；
[0011] 所述侵染液為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為10g/L 的葡萄糖和50g/L的蔗糖；
[0012] 所述共培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為9 μ M 的2, 4-二氯苯氧乙酸、0. 44 μΜ的6-芐氨基腺嘌呤、400 μΜ的乙酰丁香酮、10g/L的葡萄 糖、70g/L的蔗糖和3g/L的凝固劑；
[0013] 所述篩選培養(yǎng)基I為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為 9 μΜ的2, 4-二氯苯氧乙酸、0· 44 μΜ的6-芐氨基腺嘌呤、50mg/L的潮霉素、200mg/L的特 美汀、30g/L蔗糖的和3g/L的凝固劑；
[0014] 所述篩選培養(yǎng)基II為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為 9 μΜ的2, 4-二氯苯氧乙酸、0· 44 μΜ的6-芐氨基腺嘌呤、75mg/L的潮霉素、200mg/L的特 美汀、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固劑；
[0015] 所述再生培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為 4. 4 μΜ的6-芐氨基腺嘌呤、25mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的麥芽糖和3g/L 的凝固劑；
[0016] 所述生根培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基，并在所述MS基本培養(yǎng)基中添加最終濃度為 30g/L的蔗糖和3g/的L凝固劑。
[0017] 本發(fā)明中，所述凝固劑為植物凝膠。
[0018] 本發(fā)明中，所述侵染液和共培養(yǎng)基的pH值為5. 2,所述其他各培養(yǎng)基的pH值均為 5. 8〇
[0019] 本發(fā)明中所述的試劑盒可應(yīng)用于多年生黑麥草農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。
[0020] 本發(fā)明的另一目的為以所述試劑盒為基礎(chǔ)，提供一種多年生黑麥草農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 方法，其步驟優(yōu)選如下：
[0021] 1) ''Impact" 和 "Evening Shade" 的品系的遴選：
[0022] 將多年生黑麥草品種"Impact"和"Evening Shade"的各1000粒種子進(jìn)行脫殼和 表面消毒后置于所述發(fā)芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到分生組織；將分生組織縱向解剖一分為二置 于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，誘導(dǎo)出黃色致密的胚性愈傷組織；將所述黃色致密的愈傷組織移 至所述分化培養(yǎng)基上，遴選出再生良好的品系；
[0023] 2)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)：
[0024] 將所述遴選出的再生性良好的品系的愈傷組織上分化出的綠頭移至所述保持培 養(yǎng)基上，得到叢生芽；將所述叢生芽的分生組織橫向切下，依次接種于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I和 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上進(jìn)行培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織；
[0025] 3)制備侵染用菌液：
[0026] 先將重組農(nóng)桿菌懸浮在所述侵染液中得到重懸菌液，再將所述重懸菌液中添加終 濃度為400 μM的乙酰丁香酮，得到侵染用菌液。
[0027] 4)轉(zhuǎn)化和篩選
[0028] 將所述胚性愈傷組織和所述侵染用菌液混勻、連續(xù)搖動，將所述胚性愈傷組織取 出晾干，得到侵染后的胚性愈傷組織，將所述侵染后的胚性愈傷組織在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基 中進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)后依次移至所述篩選培養(yǎng)基I、II上，得篩選后的愈傷組織；將所述 篩選后愈傷組織在所述再生培養(yǎng)基進(jìn)行分化再生，至長出綠苗；
[0029] 5)生根和壯苗
[0030] 將所述長出綠苗的愈傷組織轉(zhuǎn)至所述生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待生根后進(jìn)一 步稱移栽至土壤中壯苗，即得到轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草。
[0031] 本發(fā)明步驟1)中所述脫殼和表面消毒的具體操作為：將種子浸泡在體積百分含 量20 %~100 %的硫酸溶液中振搖10~30分鐘進(jìn)行脫殼，將脫殼后的種子用流水洗滌1-5 小時，然后在30~60°C培養(yǎng)10~30分鐘以殺死內(nèi)生真菌，最后將種子用有效氯質(zhì)量百分 含量為3%~10%的次氯酸鈉溶液表面消毒10~30min，所述次氯酸鈉溶液中滴加10微 升Tween20 ;所述脫殼和表面消毒的操作優(yōu)選為：將種子浸泡在體積百分含量50%的硫酸 溶液中振搖20分鐘進(jìn)行脫殼，將脫殼后的種子用流水洗滌3~4小時，然后在56°C培養(yǎng)15 分鐘以殺死內(nèi)生真菌，最后將種子用有效氯質(zhì)量百分含量為5%的次氯酸鈉溶液表面消毒 20min，所述次氯酸鈉溶液中滴加10微升Tween20
[0032] 本發(fā)明步驟1)中，在所述發(fā)芽培養(yǎng)中的培養(yǎng)條件為22-25 °C黑暗培養(yǎng)5-9天和 22-25°C光照培養(yǎng)1-3天；優(yōu)選為為24°C黑暗培養(yǎng)7天和24°C光下培養(yǎng)2天；
[0033] 在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為22-25°C黑暗培養(yǎng)2-7周；優(yōu)選為為24°C黑暗 培養(yǎng)4-5周；
[0034] 在所述分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為22_25°C光照培養(yǎng)2-7周；優(yōu)選為24°C光照培 養(yǎng)4周；
[0035] 本發(fā)明步驟2)中，在所述保持培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為22_25°C光照至長出叢生 芽；優(yōu)選為24°C光照培養(yǎng)至長出叢生芽；
[0036] 在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)I中培養(yǎng)的條件為22~25°C黑暗培養(yǎng)4周，優(yōu)選為24°C黑暗培 養(yǎng)4周；
[0037] 在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)II中的培養(yǎng)條件為22~25°C黑暗培養(yǎng)，并于轉(zhuǎn)化前2-10天繼代 一次；優(yōu)選為24°C黑暗培養(yǎng)4周，并于轉(zhuǎn)化前5-7天繼代一次；
[0038] 本發(fā)明步驟3)中，所述重懸菌液中菌的濃度為OD_= 0. 6-0. 8。
[0039] 本發(fā)明步驟4)中，在所述共培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件為22-25 °C暗培養(yǎng)2-5天，優(yōu)選為 24 °C暗培養(yǎng)4天；
[0040] 在所述篩選培養(yǎng)Ι、π上的培養(yǎng)的條件均為22-25°C黑暗培養(yǎng)1-3周，優(yōu)選為24°C 黑暗培養(yǎng)2周。
[0041] 本發(fā)明步驟5)中，在所述生根培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為22-25°C光照培養(yǎng)2周，所述 壯苗的條件為