F、GyrA-R、GyrB-F、 GyrB-R、ParC-F 和 ParC-R(引物濃度分別為 25mmol/L，用 ImM Tris-HCl-0.1 mM EDTA 緩沖 液稀釋）共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括去離子水、PCR緩沖液、 終濃度均為 0. 3mmol/L 的 dNTPs (dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP)、終濃度為 0. 5mmol/L 的 GyrA-F、 終濃度為0. 5mmol/L的GyrA-R、終濃度為0. 8mmol/L的GyrB-F、終濃度為0. 8mmol/L的 GyrB-R、終濃度為0. 4mmol/L的ParC-F、終濃度為0. 4mmol/L的ParC-R和終濃度為0.0 lU/ uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParC-F 和 ParC-R 分別如 SEQ ID I、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5 和 SEQ ID6,上述 PCR 緩沖液的 10 倍母液 中包括 30mM 氯化鉀、pH8. 3 的 IOmMTris-HCl 和 0. 01 %硫酸鈉，25mM MgCl2;
[0026] 上述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50uL，反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性lOmin，然后進(jìn)入如 下循環(huán)：94 <€變性1111；[11、54<€退火508、72<€延伸1111；[11，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72 <€延 伸8min，4°C保存；
[0027] (3)步驟（2)的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5uL PCR產(chǎn)物，與IuL Loading buffer混勻后， 點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠電泳板孔中，80V電壓，電泳40min，于紫外熒光成相儀下拍照判定， 電泳結(jié)果如圖1所示，結(jié)果可見500bp左右、900bp左右、400bp左右的條帶，分別指示GryA 基因、GryB基因、ParC基因。
[0028] 同時(shí)將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物50uL和20uL三基因的上下游引物一起送深圳華大基 因有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。
[0029] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即 依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于：包括如下步 驟： (1) 收集嗜水氣單胞菌活菌體0. 5~0. 7g，用5~7mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì) 胞，離心后收集上清液，得到模板； (2) 將該模板與氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、 ParC-F和ParC-R共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩 沖液、終濃度均為0. 25~0. 35mmol/L的dNTPs、終濃度為0. 5~0. 6mmol/L的GyrA-F、終濃 度為0. 5~0. Bmmol /T,的GyrA-R、終濃度為0. 8~0. 9mmol/L的GyrB-F、終濃度為0. 8~ 0. 9mmol/L 的 GyrB-R、終濃度為 0? 4 ~0? 5mmol/L 的 ParC-F、終濃度為 0? 4 ~0? 5mmol/L 的 ParC-R 和終濃度為 0? 01 ~0? 02U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、 GyrB-R、ParC-F 和 ParC-R 分別如 SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5 和 SEQ ID 6,上述PCR緩沖液的10倍母液中包括30~35mM氯化鉀、pH8. 3的IOmMTris-HCl 和0.01~0.02%硫酸鈉，25~3011111%(：12; (3) 步驟（2)的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送交測(cè)序。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟（1)為：收集嗜水氣單胞菌活菌體〇. 5~0. 6g，用5~6mL去離子水重懸， 反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，10000~12000rpm離心10~15min后收集上清液，得到模板。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特 征在于：所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0. 3mmol/L的 L的GyrB-F、終濃度為0. 8mmol/L的GyrB-R、終濃度為0. 4mmol/L的ParC-F、終濃度為 0. 4mmol/L的ParC-R和終濃度為0.0 lU/uL的TaqDNA聚合酶。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征 在于：所述PCR緩沖液的10倍母液中包括30mM氯化鉀、pH8. 3的IOmMTris-HCl和0. 01 % 硫酸鈉，25mM MgCl2。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥 基因檢測(cè)方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：94~95°C預(yù)變性10~12min， 然后進(jìn)入如下循環(huán)：94~95°C變性50s~lmin、54~55°C退火45~50s、72~74°C延伸 50s~lmin，共30~35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸7~8min，2~4°C保存。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特 征在于：所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性10min，然后進(jìn)入如下循環(huán)：94°C變性 lmin、54°C退火50s、72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸8min，4°C保存。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟⑶的電泳條件為：2%瓊脂糖凝膠，80V電壓，時(shí)間40min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嗜水氣單胞菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟：(1)收集嗜水氣單胞菌活菌體0.5～0.7g，用5～7mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后收集上清液，得到模板；(2)將該模板與氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測(cè)引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParC-F和ParC-R共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)步驟(2)的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送交測(cè)序。本發(fā)明的檢測(cè)方法敏感、特異、快速，可以檢測(cè)極微量的目的基因進(jìn)行檢測(cè)，而不需要經(jīng)過費(fèi)時(shí)的嗜水氣單胞菌培養(yǎng)階段。
【IPC分類】C12R1-01, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104878082
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510087986
【發(fā)明人】張丹鳳, 林淦, 胡元慶, 陳凡, 陳國平, 潘裕添
【申請(qǐng)人】閩南師范大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年2月26日