一種基于定位探針介導(dǎo)剪切和擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于定位探針介導(dǎo)剪切和擴(kuò)增的 核酸檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 病原體和遺傳標(biāo)志物相關(guān)基因的定性和定量檢測(cè)已成為臨床化學(xué)中發(fā)展最迅速 的領(lǐng)域之一。由于即時(shí)檢測(cè)的需要，核酸檢測(cè)正逐步走出實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。但目前，核酸檢測(cè)仍 主要使用PCR技術(shù)和其衍生技術(shù)如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)PCR(Real-time PCR)、多重 PCR (Multiplex PCR)、巢式PCR (Nested PCR)等。這些技術(shù)嚴(yán)重依賴于循環(huán)變溫過程來實(shí) 現(xiàn)核酸鏈的變性、退火和延伸三步驟，屬于變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，需要專門的實(shí)驗(yàn)室儀器，因 而不利于即時(shí)檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)。
[0003] 近年來，等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)逐漸興起，并得以迅猛發(fā)展，不僅豐富了核酸擴(kuò)增 技術(shù)的內(nèi)容，還代表著核酸擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展的新趨勢(shì)。目前已報(bào)到的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（Transcription-mediated amplification，TM)、鏈置換擴(kuò)增技 術(shù)（Strand displacement amplification，SDA)、基于核酸序列擴(kuò)增技術(shù)（Nucleic acid sequence-based amplification， NASBA)、環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated amplification，LAMP)、解鏈酶依賴型擴(kuò)增技術(shù)（Helicase dependent amplification， HDA)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification，RCA)、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (Single primer isothermal amplification，SPIA)和基因指數(shù)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（Genome exponential amplification reaction，GEAR)等。這些等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)避免了 PCR 技 術(shù)的循環(huán)升、降溫過程，能在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸序列的指數(shù)擴(kuò)增，使核酸檢測(cè)設(shè)備 更加便攜，有利于即時(shí)檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)。然而，這些技術(shù)均是從人工合成引物沿目標(biāo)核酸序列 延伸開始啟動(dòng)，其主要缺點(diǎn)在于引物設(shè)計(jì)上的困難。為了實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸序列以及新生成的 反義序列的循環(huán)利用，常常需要復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)，例如LAMP需要針對(duì)目標(biāo)核酸序列的6個(gè) 區(qū)域設(shè)計(jì)至少4條引物，這不僅要依賴于專業(yè)的設(shè)計(jì)軟件，還要求設(shè)計(jì)者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)。 SDA等雖然具有相對(duì)簡(jiǎn)單的反應(yīng)機(jī)理，但由于內(nèi)切酶對(duì)于目標(biāo)核酸中特定識(shí)別序列的依賴， 其通用性受到了很大挑戰(zhàn)。為了在目標(biāo)核酸中引入內(nèi)切酶的識(shí)別序列，也不得不訴諸于復(fù) 雜的引物設(shè)計(jì)，這不僅大大增加了非特異性擴(kuò)增的嚴(yán)重程度，同時(shí)加大了擴(kuò)增失敗的風(fēng)險(xiǎn)。 另一方面，從引物延伸開始啟動(dòng)的擴(kuò)增反應(yīng)還缺乏有效的手段來抑制非特異性擴(kuò)增反應(yīng)， 這是目前絕大多數(shù)等溫指數(shù)擴(kuò)增方法尚未解決的難題。相比較而言，從目標(biāo)核酸序列的延 伸開始啟動(dòng)的等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)不僅可以靈活設(shè)計(jì)引物/模板的序列結(jié)構(gòu)，而且可以采用 各種化學(xué)修飾的引物/模板以降低非特異性擴(kuò)增。但絕大多數(shù)情況下，待測(cè)目標(biāo)核酸序列 的3'段斷點(diǎn)位置是不可知的，這就使得目標(biāo)核酸序列沿特定引物/模板的延伸面臨著巨大 的挑戰(zhàn)。使用 "Fingerprinting" 技術(shù)（Niemz，A. (2009)，Clin. Chem. 53 :2017-2020)雖然 可以從基因組靶核酸序列中直接得到擴(kuò)增"引物"，即利用內(nèi)切酶對(duì)目標(biāo)核酸序列實(shí)施剪切 以精確"自定義"其3'段斷點(diǎn)位置，從而引發(fā)指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，但是這種方法需要目標(biāo)核酸序 列中含有內(nèi)切酶識(shí)別序列，且剪切位點(diǎn)只能位于該識(shí)別序列內(nèi)或附近的某一固定位置，無 法按實(shí)際需要實(shí)現(xiàn)精細(xì)調(diào)節(jié)，針對(duì)不同的目標(biāo)核酸序列來還需選擇不同的內(nèi)切酶才能實(shí)現(xiàn) 剪切，因而其通用性較差，對(duì)于有些序列片段甚至?xí)捎跊]有適合的內(nèi)切酶而無法實(shí)現(xiàn)特 異性剪切。為了克服上述不足，有必要探宄一種新的核酸檢測(cè)方法，應(yīng)用于微生物檢測(cè)、月中 瘤標(biāo)志物鑒定和轉(zhuǎn)基因成分篩查等方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種基于定位探針介導(dǎo)剪切和擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法，該方法是一種 可對(duì)目標(biāo)核酸序列任意位點(diǎn)進(jìn)行剪切，生成相應(yīng)的核酸序列作為引物以觸發(fā)后續(xù)等溫指數(shù) 擴(kuò)增反應(yīng)的簡(jiǎn)單、通用的核酸檢測(cè)方法。
[0005] 一種核酸檢測(cè)方法，包括酶切目標(biāo)核酸序列、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，酶切目標(biāo)核酸序列所 采用的試劑包括定位探針和內(nèi)切酶，所述定位探針包括一段雙鏈以及至少一段與雙鏈相連 接的單鏈，所述單鏈具有可與目標(biāo)核酸序列特異性雜交的識(shí)別區(qū)，所述雙鏈具有鄰近識(shí)別 區(qū)的供內(nèi)切酶結(jié)合的結(jié)合區(qū)。
[0006] 上述方法中內(nèi)切酶與所述定位探針的雙鏈結(jié)合區(qū)進(jìn)行結(jié)合，并通過單鏈的識(shí)別區(qū) 與目標(biāo)核酸序列進(jìn)行雜交被定位到目標(biāo)核酸序列的指定區(qū)域內(nèi)，從而完成對(duì)目標(biāo)核酸序列 的精確剪切。
[0007] 上述核酸檢測(cè)方法是在現(xiàn)有依賴鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的核酸檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上做的 進(jìn)一步改進(jìn)，以熒光分析方法進(jìn)行核酸檢測(cè)為例，主要包括以下幾個(gè)過程：目標(biāo)核酸序列的 剪切、鏈置換擴(kuò)增和熒光檢測(cè)。
[0008] 該方法的整個(gè)反應(yīng)體系中，主要包括以下組分：待檢測(cè)的目標(biāo)核酸序列，具有鏈置 換活性的核苷酸聚合酶（簡(jiǎn)稱聚合酶），擴(kuò)增模板，定位探針，內(nèi)切酶，反應(yīng)緩沖液，dNTPs、 鎂離子和熒光探針。
[0009] 該方法的具體反應(yīng)原理，如下：
[0010] a)定位探針會(huì)與目標(biāo)核酸序列進(jìn)行特異性雜交，而內(nèi)切酶與定位探針的雙鏈結(jié)合 區(qū)結(jié)合，并對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行剪切；
[0011] b)剪切后，目標(biāo)核酸序列與定位探針分離，轉(zhuǎn)而與擴(kuò)增模板上3'端的目標(biāo)核酸結(jié) 合序列特異性結(jié)合，并在聚合酶的作用下，以擴(kuò)增模板為模板延伸，延伸的核酸序列與擴(kuò)增 模板形成雙鏈的內(nèi)切酶識(shí)別序列以及擴(kuò)增模板5'端的擴(kuò)增序列的反義序列；
[0012] c)內(nèi)切酶與b)中形成的雙鏈的內(nèi)切酶識(shí)別序列結(jié)合，并對(duì)目標(biāo)核酸序列的延伸 序列進(jìn)行剪切，形成切口，然后聚合酶從該切口位置開始催化延伸，并置換掉原有核酸序 列，該剪切-延伸過程不斷重復(fù)，以生成更多的擴(kuò)增序列的反義序列；
[0013] d)該反義序列與游離的擴(kuò)增模板特異性結(jié)合，并在聚合酶的作用下以擴(kuò)增模板為 模板延伸，延伸的核酸序列與擴(kuò)增模板形成雙鏈的內(nèi)切酶識(shí)別序列以及擴(kuò)增模板5'端的擴(kuò) 增序列的反義序列；
[0014] e)不斷重復(fù)步驟c)和d)以實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增，由于可產(chǎn)生大量的雙鏈擴(kuò)增模板，因而 將使雙鏈特異性熒光染料SYBR Green I的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸序列的 檢測(cè)。
[0015] 核酸定位探針的結(jié)合區(qū)只是核酸定位探針雙鏈中的一部分區(qū)域，結(jié)合區(qū)的兩端還 可以有非內(nèi)切酶識(shí)別序列；同樣，上述識(shí)別區(qū)也只是核酸定位探針單鏈的一部分區(qū)域，識(shí)別 區(qū)的兩端還可以有非目標(biāo)核酸識(shí)別序列；但是，結(jié)合區(qū)與識(shí)別區(qū)必須相互靠近，以確保內(nèi)切 酶能夠剪切到目標(biāo)核酸序列，結(jié)合區(qū)與識(shí)別區(qū)之間可允許間隔的堿基對(duì)數(shù)（單鏈區(qū)按核苷 酸數(shù)計(jì)）根據(jù)內(nèi)切酶的類型來確定。
[0016] 本發(fā)明所述的"靠近"是指結(jié)合區(qū)與識(shí)別區(qū)不宜間隔過大，以避免內(nèi)切酶無法剪切 目標(biāo)核酸序列，結(jié)合區(qū)與識(shí)別區(qū)相互間隔的核苷酸數(shù)應(yīng)根據(jù)具體內(nèi)切酶識(shí)別序列與剪切位 點(diǎn)間的核苷酸數(shù)量來確定。
[0017] 作為優(yōu)選，所述核酸定位探針包含兩段含識(shí)別區(qū)的單鏈，兩段單鏈連接于雙鏈的 同一端，或者所述核酸定位探針包括單鏈環(huán)，所述單鏈環(huán)和單鏈分別連接于雙鏈的兩端。
[0018] 更優(yōu)選的是，所述核酸定位探針不僅包含兩段含識(shí)別區(qū)的單鏈，兩段單鏈連接于 雙鏈的同一端，而且還包括單鏈環(huán)，所述單鏈環(huán)和單鏈分別連接于雙鏈的兩端。
[0019] 進(jìn)一步地，所述單鏈環(huán)的核苷酸數(shù)量大于等于0,小于等于50。
[0020] 理論上，本發(fā)明所述的核酸定位探針只需具有結(jié)合區(qū)和識(shí)別區(qū)即可實(shí)現(xiàn)核酸剪 切，針對(duì)上述結(jié)構(gòu)區(qū)域，本發(fā)明提供了多種可行的核酸定位探針結(jié)構(gòu)，具體如下：
[0021] 所述核酸定位探針由單條核苷酸鏈分子內(nèi)互補(bǔ)雜交形成或由兩條核苷酸鏈部分 互補(bǔ)雜交形成。
[0022] 若以兩條核苷酸鏈形式存在，該核酸定位探針的兩條核苷酸鏈中存在一部分互補(bǔ) 序列，互補(bǔ)區(qū)域中需包含結(jié)合區(qū)以供內(nèi)切酶結(jié)合，未互補(bǔ)