一種預(yù)測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種預(yù)測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的試劑，更具體的說 是通過測定與AMD相關(guān)基因 VEGF-A的多態(tài)性預(yù)測受試者對于雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃 斑變性的易感性，該方法可用于指導(dǎo)年齡相關(guān)性黃斑變性雷珠單抗的個體化治療，屬于生 物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 年齡相關(guān)性黃斑變性（Age-related macular degeneration，AMD)是西方 50 歲以 上人群致盲的首要原因，研宄發(fā)現(xiàn)AMD可能與紫外線照射、微量元素缺乏等有關(guān)，但具體病 因仍不清楚。國內(nèi)的調(diào)查顯示，年齡相關(guān)性黃斑變性發(fā)病率為15. 5%，其發(fā)病率隨著年齡的 增加而增加。隨著人口老齡化的到來，年齡相關(guān)性黃斑變性已經(jīng)成為我國老年人致盲的首 要原因。主要表現(xiàn)是患者視物變形、視力下降、眼前黑影遮擋，眼底表現(xiàn)是出血、滲出，嚴(yán)重 者視力完全喪失，進(jìn)而嚴(yán)重危害老年人的生活質(zhì)量。
[0003] AMD屬多基因疾病，具有明顯的遺傳傾向，雖然通常認(rèn)為遺傳與環(huán)境因素在AMD發(fā) 病中起主導(dǎo)作用，但確切的病因與發(fā)病機(jī)制仍不清楚。
[0004] 研宄發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)是 導(dǎo)致年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD)脈絡(luò)膜新生血管（CNV)形成的關(guān)鍵因子，抗VEGF藥物雷珠 單抗能夠結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子A (VEGF-A)所有亞型，有效抑制CNV的生長及滲漏，但仍有 25. 8 %患者治療后最終視力低于基線視力。
[0005] 目前進(jìn)行AMD遺傳病因研宄，多采用SNP作為基因組標(biāo)志的關(guān)聯(lián)分析方法，是有效 的。SNP是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率 需>1%，SNPs是雙等位基因標(biāo)記，這種單堿基變化中有70. 1 %為同型堿基之間的轉(zhuǎn)換：如 G/A或T/C，29. 1 %為發(fā)生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C (胞嘧啶）是人類基因組中最易發(fā)生 變化的位點(diǎn)，因為大多數(shù)是甲基化胞嘧啶，能夠自發(fā)脫氨基轉(zhuǎn)換為T(胸腺嘧啶），SNP包含 了已知多態(tài)性的80-90%，是最常見的遺傳變異。
[0006] 由于生存的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。 SNPs在基因非編碼區(qū)的數(shù)量是編碼區(qū)的4倍，總數(shù)可達(dá)3百萬個。SNP以其密度高（平均 每Ikb就有1個）、代表性強(qiáng)（位于基因內(nèi)部的SNP可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平）、 遺傳穩(wěn)定性好（同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言）、易于自動化分析（因 SNP在人群中多為雙等位 基因標(biāo)記，可簡單以"+/ -或1/0"直接分型）等特點(diǎn)成為很好的遺傳標(biāo)志。
[0007] 目前國外多選取WAMD易感基因研宄其與雷珠單抗療效的相關(guān)性。有報道研宄藥 物治療的靶基因及其通路VEGF及VEGFR變異與雷珠單抗療效的相關(guān)性，但結(jié)論不一致。目 前尚無任何關(guān)于VEGF-A基因 rs3025018T>G位點(diǎn)與雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效 相關(guān)的研宄結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的主要目的是提供一種預(yù)測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的方 法。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種預(yù)測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的 試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0011] 一種預(yù)測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的方法，通過提取宿主細(xì)胞的基 因組DNA，測定受試者的VEGF-A基因第6內(nèi)含子rs3025018T>G位點(diǎn)的基因型，預(yù)測受試者 對雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性的療效；VEGF-A基因第6內(nèi)含子區(qū)rs3025018T>G位 點(diǎn)的基因型為GT時，受試者對雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性的療效較好；攜帶G等位 基因時，受試者對雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性的療效較好。
[0012] 本發(fā)明提供了一種分離核酸，具有SEQ ID No. 1所示的堿基序列，其+501位即是 變異位點(diǎn)，以字母"B"標(biāo)示出。該核酸序列為VEGF-A基因全長序列。圖1為VEGF-A基 因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性變異位點(diǎn)的示意圖，附圖中包含有7個外顯子，rs3025018T>G位點(diǎn)標(biāo)在 VEGF-A基因圖中第6內(nèi)含子區(qū)的相應(yīng)位置。
[0013] 本發(fā)明提供了一組檢測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的特異性引物，具 有SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的堿基序列，長度均為20bp，而且可以特異性地擴(kuò)增出 包含有SEQ ID No. 1所示序列中+501位置的產(chǎn)物。
[0014] 本發(fā)明提供了一種檢測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的診斷試劑盒，其 中含有本發(fā)明特異性擴(kuò)增VEGF-A基因+501位點(diǎn)的引物對和用于PCR擴(kuò)增檢測的試劑盒的 常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些常規(guī)組件和檢測方法。本發(fā)明試劑盒 中的全部組分、含量、來源和使用方法如下：
[0015] -種檢測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的診斷試劑盒，含有SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的特異性引物。
[0016] -種檢測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的診斷試劑盒，由以下試劑組 成：
[0017] 30 μ L 10 X PCR 緩沖液；
[0018] 5 μ L濃度為IOmM的dNTP混合液；
[0019] 5 μ L濃度為2U/ μ L的TaqDNA聚合酶；
[0020] 2. 5 μ L 濃度為 IOpM/ μ L 的 Fl 引物；
[0021] 2. 5 yL濃度為 IOpM/yL 的 Rl 引物；
[0022] 235 μ L 純水。
[0023] 所述Fl引物具有SEQ ID No. 2所示的堿基序列；Rl引物具有SEQ ID No. 3所示 的堿基序列。
[0024] 使用方法：
[0025] 1)PCR擴(kuò)增：通過PCR擴(kuò)增VEGF-A基因的第6內(nèi)含子區(qū)部分片段，制備混合液： 10XPCR 反應(yīng)緩沖液 3 μ L，10mM/L dNTP 0· 5 μ L，TaqDNA 聚合酶 0· 5 μ L，10pM/L 上游引物 0. 5yL，10pM/L下游引物0. 5yL，基因組DNA 2yL，加純水至30yL。PCR反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性5min，95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸25s，總共35個循環(huán)，72°C總延伸2min。 PCR前于每一體系中加入20 μ L的石蠟油，以防止液體揮發(fā)。
[0026] 2)基因型判定：將PCR產(chǎn)物直接測序，根據(jù)熒光信號的差異判定基因型。
[0027] 本發(fā)明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品來源無限制，如：體液（血 液、腹水及尿液等）、組織細(xì)胞（如肝組織）等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組 DNA。調(diào)整基因組DNA的濃度，使其盡可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴(kuò)增出含VEGF-A 基因突變位點(diǎn)的核酸片段，以獲取測定的大量樣本。這種通過擴(kuò)增含VEGF-A基因變異點(diǎn)的 DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測定材料。
[0028] 在進(jìn)行基因輔助診斷時，本發(fā)明優(yōu)先適用于測定根據(jù)VEGF-A基因的突變類型 存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應(yīng)于用于測定 VEGF-A基因突變類型的方法。按采用的測定方法來選擇適當(dāng)?shù)奶囟ㄔ噭?，如DNA片段和/ 或用于PCR擴(kuò)增步驟的引物。
[0029] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明首次闡明了 VEGF-A基因多態(tài)性位點(diǎn)與雷珠單抗治療年 齡相關(guān)性黃斑變性療效相關(guān)性，提供了一種預(yù)測雷珠單抗治療年齡相關(guān)性黃斑變性療效的 方法，該方法可用于指導(dǎo)年齡相關(guān)性黃斑變性雷珠單抗的個體化治療。
[0030] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，以便公眾對
【發(fā)明內(nèi)容】
有更 深入的了解，并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換， 均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【附圖說明】
[0031] 圖1為VEGF-A基因結(jié)構(gòu)