一種食品中致病菌定量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種食品微生物的快速檢測(cè)方法，尤 其涉及一種食品中致病菌的定量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品安全是一個(gè)世界性的影響人類健康的重大問題，其與人類生存環(huán)境和社會(huì)穩(wěn) 定息息相關(guān)。其中細(xì)菌性食物中毒的危害最為嚴(yán)重，感染者輕可造成發(fā)熱、頭痛、腹痛、腹瀉 和嘔吐，重則會(huì)出現(xiàn)肌肉痙攣，甚至休克直至死亡，因此微生物的檢驗(yàn)成為食品檢測(cè)必不可 少的重要組成部分，是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是判定被檢食品能否食用的 科學(xué)依據(jù)之一。通過食品微生物檢驗(yàn)，還可以判斷食品加工衛(wèi)生環(huán)境，能夠?qū)κ称繁患?xì)菌污 染的程度做出正確的評(píng)價(jià)，為各項(xiàng)衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)，提供傳染病和人畜食物中 毒的防治措施。
[0003] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒的細(xì)菌種類中，最常見的主要是沙門氏菌、單核 細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌等等。針對(duì)這些細(xì)菌及其他 易危害人體健康的食品微生物，現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要依賴于微生物富集培養(yǎng)-選擇性分 離-生化鑒定方法，該方法存在手工操作繁瑣費(fèi)時(shí)、檢測(cè)靈敏度低、易出現(xiàn)假陰性等缺陷， 且衛(wèi)生指導(dǎo)反饋慢，給商品生產(chǎn)和流通帶來一定的影響。此外還有常用的免疫學(xué)方法和基 因探針法，前者雖能彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的一些不足，但也有誤差大、周期長(zhǎng)的局限性；而后者也 存在檢測(cè)費(fèi)用昂貴、實(shí)驗(yàn)步驟多且費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。因此研宄食品微生物快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢 測(cè)方法以預(yù)防和控制食品安全事件的發(fā)生，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0004] 針對(duì)上述問題，近年來微生物學(xué)專家和工程技術(shù)人員密切合作，采用了各種物理 化學(xué)及生物技術(shù)對(duì)如何快速準(zhǔn)確經(jīng)濟(jì)的鑒定微生物進(jìn)行了研宄分析，如采用了光散射技 術(shù)、發(fā)光技術(shù)、色譜技術(shù)、電氣電子技術(shù)、免疫技術(shù)及放射技術(shù)等，并基于上述分析技術(shù)發(fā)明 了許多定性或定量鑒定微生物的分析方法。常見的有：（1)檢測(cè)某些細(xì)菌的專有酶及代謝 產(chǎn)物進(jìn)行快速鑒定；（2)應(yīng)用免疫學(xué)方法檢測(cè)微生物抗原或抗體，如放射免疫分析（RIA)、 酶免疫分析（EIA)、熒光免疫分析（FIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CIA)、生物發(fā)光免疫分析 (BIA)等；（3)細(xì)菌毒素的快速檢測(cè)；(4)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)的快速檢測(cè)；(5)分 子生物學(xué)技術(shù)在檢測(cè)微生物中的應(yīng)用，如核酸探針（Nuclear acid probe)、聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase chain reaction，PCR)、基因芯片技術(shù)（microarray)等；（6)快速檢測(cè)細(xì)菌生 化反應(yīng)及成套鑒定系統(tǒng)；（7)病原微生物的自動(dòng)化系統(tǒng)，其中最有代表性的是AMS微生物自 動(dòng)分析系統(tǒng)。
[0005] 目前應(yīng)用最多的是采用多重PCR方法來進(jìn)行食品中微生物的檢測(cè)，例如楊國(guó)興在 多重PCR檢測(cè)肉及肉制品中四種食源性致病菌的研宄中，根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸 酶基因 nuc、沙門氏菌的侵染性質(zhì)?？乖瑽基因 ipaB、志賀氏菌的侵染性質(zhì)?？乖璈基因 ipaH、單核增生李斯特氏菌的內(nèi)化素 A基因 inlA設(shè)計(jì)了四對(duì)特異性引物，進(jìn)行多重PCR反 應(yīng)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)四種食源性致病菌的檢測(cè)；試驗(yàn)過程中對(duì)多重PCR反應(yīng)體系中引物添加 量、鎂離子濃度、dNTP混合物添加量及退火溫度和循環(huán)數(shù)等影響要素進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜 的多重PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序（參見楊國(guó)興，"多重PCR檢測(cè)肉及肉制品中四種食源性 致病菌的研宄"，中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫，2008年6月10日）；另外，蘇裕心在建立 幾種食源性致病菌熒光定量PCR的檢測(cè)方法時(shí)，采用通過lambda噬菌體DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選 物的制備研宄，進(jìn)行金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、沙門氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌DNA 基因組定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備研宄；并利用SmartCycler系統(tǒng)建立一種高敏、特異、簡(jiǎn)便、快 速的qPCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、沙門氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌的方法， 并在LightCycler2. 0, ABI 7300儀器上對(duì)所建立的體系進(jìn)行評(píng)估（參見蘇裕心，"幾種食 源性致病菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立"，中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫，2010年5月26 日）。從目前的研宄來看，對(duì)于食品微生物進(jìn)行多重PCR檢測(cè)時(shí)，主要集中在對(duì)PCR程序的 改進(jìn)上，其存在微觀、不易操作的缺陷，并對(duì)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)室的要求比較高，而且容易出現(xiàn)假 陽性和假陰性樣本。
[0006] 目前也有一些研宄證實(shí)，通過調(diào)整混合培養(yǎng)基可以有效增殖致病菌，從而有助于 定量檢測(cè)食品中的微生物，例如楊軍等研宄了多重PCR法對(duì)食品中3種致病菌的同時(shí)快速 檢測(cè)，其通過調(diào)整混合培養(yǎng)基的配比摸索了食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌 的快速共增菌條件，使得3種致病菌在37°C搖床培養(yǎng)后濃度達(dá)到IO fVmL(參見楊軍等，"多 重PCR法對(duì)食品中3種致病菌的同時(shí)快速檢測(cè)"，中國(guó)乳品工業(yè)，第38卷第4期，2010年4 月25日）。然而，由于該研宄只針對(duì)上述3種致病菌的檢測(cè)，其存在一定的局限性，而對(duì)于 食品中的其它致病菌是否能夠進(jìn)行同時(shí)快速檢測(cè)尚未知否。
[0007] 上述各種方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，在高效快速方面雖已具有較大的進(jìn)步，但仍 不能適應(yīng)日益嚴(yán)格的食品質(zhì)量檢測(cè)方面的高要求。而且，上述各方法中PCR鑒定方法基本 上具備了食品微生物檢驗(yàn)新要求的各種條件，但在實(shí)際操作中仍會(huì)存在假陽性和無法判斷 微生物活性狀態(tài)等問題，因此如何尋找一種靈敏度高、特異性好，經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的食品尤其是 食品中致病菌的定量檢測(cè)方法是目前亟待解決的問題。
[0008] CN103388031A中公開了一種結(jié)合非特異性擴(kuò)增和多點(diǎn)RTQ-PCR的食品微生物檢 測(cè)方法，雖然其公開了將非特異性擴(kuò)增培養(yǎng)、多點(diǎn)實(shí)時(shí)定量采樣及特異性實(shí)時(shí)定量PCR鑒 定技術(shù)結(jié)合起來，并根據(jù)PCR結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析來檢測(cè)食品微生物的方法，然而，其所用的 非特異性擴(kuò)增培養(yǎng)基為緩沖蛋白胨水，其對(duì)于沙門氏菌的擴(kuò)增效果較好，但對(duì)于其它微生 物的擴(kuò)增效果卻有限，因此，有必要尋找一種適合同時(shí)擴(kuò)增多種食品微生物并使其均達(dá)到 良好擴(kuò)增效率的非特異性擴(kuò)增培養(yǎng)基；另外，該方法中對(duì)于最優(yōu)的非零時(shí)刻的選取并不明 確，其分別在3h、6h、9h和24h進(jìn)行了檢測(cè)，在表1中列舉了 6h、8h、10h和12h所對(duì)應(yīng)的Ct 值，盡管從表1中可以看出Ct值成下降趨勢(shì)，然而，其首先并未明確在哪個(gè)非零時(shí)刻的選取 可以同時(shí)使各種微生物的擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)最大效率，另外，更沒有明確Ct值選取何值時(shí)可以判定 食品中含有致病菌，甚至致病菌中活菌和死菌的情況，因此，如何明確上述問題也是目前急 需解決的一個(gè)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種食品中致病菌的定量檢測(cè)方法，特別提供了一種 在短時(shí)間內(nèi)判斷出食品中致病菌的污染程度、活菌比例、致病菌活性狀況及污染歷史的定 量檢測(cè)方法，通過該方法可以由目前使用的7天的細(xì)菌培養(yǎng)方法縮短至24小時(shí)；準(zhǔn)確度由 目前的生理生化標(biāo)準(zhǔn)提高至分子水平；靈敏度可以達(dá)到單個(gè)菌；準(zhǔn)確度和特異性都可以在 99%以上。
[0010] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0011] 第一方面，本發(fā)明提供了一種食品中致病菌定量檢測(cè)方法，其包括以下步驟： [0012] (1)擴(kuò)增步驟：將疑似含有目標(biāo)致病菌的樣品通過非特異性培養(yǎng)進(jìn)行致病菌的擴(kuò) 增；
[0013] (2)實(shí)時(shí)定量取樣步驟：在步驟（1)所述