用于cdr移植的接受體框架的制作方法
【專利說(shuō)明】用于CDR移植的接受體框架
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 作為治療劑和診斷劑，單克隆抗體、它們的綴合物和衍生物在商業(yè)上極其重要。通 常在單次低劑量注射之后，非人抗體在患者中引發(fā)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)（Schroff，1985Cancer Res45:879-85 ；Shawler.JImmunol1985 135:1530-5 ；Dillman,CancerBiother1994 9:17-28)。因此，開發(fā)了用于降低鼠類和其它嚙齒動(dòng)物抗體的免疫原性的若干方法以及用 以使用例如轉(zhuǎn)基因小鼠或噬菌體展示來(lái)制備完全人抗體的技術(shù)。嵌合抗體是工程化抗體， 其組合嚙齒動(dòng)物可變區(qū)與人恒定區(qū)（例如BoulianneNature1984 312:643-6)，使免疫原 性問(wèn)題顯著減少（例如LoBuglio，ProcNatlAcadSci1989 86:4220-4 ;Clark,Immunol Today2000 21:397-402)。人源化抗體也是工程化抗體，其中嚙齒動(dòng)物可變區(qū)序列自身被 工程化來(lái)盡可能接近人序列，同時(shí)保留至少原始CDR，或其中將來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體的CDR移 植到人抗體的框架中（例如Riechmann,Nature1988 332:323-7 ;US5, 693, 761)。兔多克 隆抗體廣泛用于生物測(cè)定，如ELISA或蛋白質(zhì)印跡。多克隆兔抗體時(shí)常由于它們的親和力 通常高得多而比多克隆嚙齒動(dòng)物抗體更有利。此外，兔時(shí)常能夠引發(fā)針對(duì)在小鼠中免疫原 性不良和/或當(dāng)用于噬菌體展示時(shí)不產(chǎn)生良好結(jié)合劑的抗原的良好抗體反應(yīng)。由于兔抗體 具有這些熟知優(yōu)勢(shì)，它們將理想地用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)治療性抗體。通常不進(jìn)行此舉的原因主 要是由于產(chǎn)生單克隆兔抗體的技術(shù)挑戰(zhàn)。因?yàn)楣撬枇鰳幽[瘤在兔中是未知的，所以用以產(chǎn) 生單克隆抗體的常規(guī)雜交瘤技術(shù)不可用于兔抗體。提供兔抗體表達(dá)細(xì)胞的融合細(xì)胞系伴侶 的開拓性工作已由Knight和同事進(jìn)行（Spieker-Polet等，PNAS1995, 92:9348-52)，并且 一種改進(jìn)融合伴侶細(xì)胞系已由Pytela等在2005年描述（參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)7429487)。 然而，這個(gè)技術(shù)并未廣泛推廣，因?yàn)橄鄳?yīng)訣竅基本上由單一研宄組控制。涉及通過(guò)RT-PCR 自所選抗體表達(dá)細(xì)胞克隆抗體的用于產(chǎn)生單克隆抗體的替代性方法描述于文獻(xiàn)中，但從未 對(duì)兔抗體進(jìn)行成功報(bào)道。
[0003] 類似小鼠抗體，預(yù)期兔抗體如果用于人療法，那么會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，因此，兔 抗體在它們可臨床使用之前需要被人源化。然而，歸因于兔與小鼠之間，并且相應(yīng)地，兔抗 體與人抗體之間的結(jié)構(gòu)差異，用于制備人源化嚙齒動(dòng)物抗體的方法并不能容易地外推用于 兔抗體。舉例來(lái)說(shuō)，輕鏈CDR3(CDRL3)常比先前已知的來(lái)自人或小鼠抗體的CDRL3長(zhǎng)得多。 [0004] 存在少許描述于先前技術(shù)中的兔抗體人源化方法，然而，其不是其中非人供體 的⑶R被移植在人接受體抗體上的經(jīng)典移植方法。W0 04/016740描述一種所謂"表面重 塑"策略。"表面重塑"策略的目標(biāo)在于重新塑造非人框架的溶劑可及殘基以使它們變得 更類人。如W0 04/016740中所述的用于兔抗體的類似人源化技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。 W008/144757與W005/016950兩者均公開用于使兔單克隆抗體人源化的方法，其涉及比較 親本兔抗體的氨基酸序列與類似人抗體的氨基酸序列。隨后，改變親本兔抗體的氨基酸序 列以使它的框架區(qū)在序列方面更類似于類似人抗體的等效框架區(qū)。為獲得良好結(jié)合能力， 需要個(gè)別地針對(duì)各免疫結(jié)合劑進(jìn)行費(fèi)力開發(fā)嘗試。
[0005] 上述方法的一個(gè)潛在問(wèn)題是不使用人框架而是使兔框架工程化以使它看起來(lái)更 類人。所述方法攜有包埋在蛋白質(zhì)的核心中的氨基酸鏈段仍然可能包含免疫原性T細(xì)胞表 位的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006] 迄今為止，申請(qǐng)人尚未鑒定通過(guò)應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)移植方法加以人源化的兔抗 體。這可能用兔CDR可十分不同于人或嚙齒動(dòng)物CDR的事實(shí)來(lái)解釋。如本領(lǐng)域中所知，許 多兔VH鏈相對(duì)于鼠類和人對(duì)應(yīng)物具有額外成對(duì)半胱氨酸。除在cys22與cys92之間形成 的保守二硫橋之外，也存在cyS21-cyS79橋，以及在一些兔鏈中在⑶RH1的末個(gè)殘基與⑶R H2的首個(gè)殘基之間形成的⑶R間S-S橋。此外，多對(duì)半胱氨酸殘基常見(jiàn)于⑶R-L3中。此 外，許多兔抗體CDR不屬于任何先前已知的典型結(jié)構(gòu)。具體來(lái)說(shuō)，CDR-L3常比人或鼠類對(duì) 應(yīng)物的⑶R-L3長(zhǎng)得多。
[0007] 因此，將非人⑶R抗體移植到人框架中是主要蛋白質(zhì)工程任務(wù)。必須在使天然環(huán) 構(gòu)象得以保留以達(dá)成抗原結(jié)合下進(jìn)行將抗原結(jié)合環(huán)自天然進(jìn)化的框架轉(zhuǎn)移至不同人工選 擇的人框架。常常在環(huán)移植之后，抗原結(jié)合親和力被極大降低或消除。在移植抗原結(jié)合環(huán) 時(shí)使用謹(jǐn)慎選擇的人框架會(huì)使人源化分子中保留結(jié)合親和力的可能性最大（Roguzka等 1996)。盡管可在文獻(xiàn)中獲得的許多移植實(shí)驗(yàn)提供用于CDR移植的大致指導(dǎo)，但不可能概括 某一樣式。典型問(wèn)題在于在移植⑶R環(huán)之后損失特異性、穩(wěn)定性或可產(chǎn)生性。
[0008] 因此，對(duì)用于可靠并快速使兔抗體人源化以用作治療劑和診斷劑的改進(jìn)方法存在 緊急需要。此外，對(duì)用于可靠使兔抗體人源化，從而提供具有藥物樣生物物理學(xué)性質(zhì)的功能 性抗體和/或抗體片段的人接受體框架存在需要。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 已驚人地發(fā)現(xiàn)通過(guò)質(zhì)量控制（QC)測(cè)定（如W0 0148017中以及AufderMaur等 (2001)，F(xiàn)EBSLett508,第407-412頁(yè)中所公開）鑒定的高度可溶性和穩(wěn)定人抗體框架特 別適于接納來(lái)自其它非人動(dòng)物物種的CDR，例如兔CDR。因此，在第一方面，本發(fā)明提供特定 人抗體的重鏈可變區(qū)（所謂"a58"VH框架序列），其尤其適合作為來(lái)自具有不同結(jié)合特異 性的多種抗體，特別是來(lái)自兔抗體的CDR的接受體，而與二硫橋是否存在于CDR中無(wú)關(guān)。
[0011] 通過(guò)將兔CDR移植到這個(gè)可高度相容的可變鏈框架中產(chǎn)生的人源化免疫結(jié)合劑 始終并可靠保留供體CDR所源于的兔抗體的空間取向。因此，供體免疫結(jié)合劑的結(jié)構(gòu)相關(guān) 位置無(wú)需被引入接受體框架中。歸因于這些優(yōu)勢(shì)，可達(dá)成在不優(yōu)化或少許優(yōu)化結(jié)合能力下 對(duì)兔抗體的高通量人源化。
[0012] 因此，在另一方面，本發(fā)明提供用于將兔和其它非人CDR移植到本文公開的可溶 性和穩(wěn)定輕鏈和/或重鏈人抗體框架序列中，由此產(chǎn)生具有優(yōu)越生物物理學(xué)性質(zhì)的人源化 抗體的方法。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的免疫結(jié)合劑展現(xiàn)優(yōu)越功能性質(zhì)，如可溶性和 穩(wěn)定性。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述
[0014]圖1描繪在本文中用于將抗原結(jié)合位點(diǎn)自兔單克隆抗體移植到高度可溶性和穩(wěn) 定人抗體框架中的CDRH1定義。
[0015] 圖2 :對(duì)自Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)提取的兔抗體序列的分析確認(rèn)可變重鏈的⑶R3通常比它 的鼠類對(duì)應(yīng)物長(zhǎng)3個(gè)氨基酸。
[0016] 發(fā)明詳述
[0017] 定義
[0018] 為使本發(fā)明可更易于理解，將如下定義某些術(shù)語(yǔ)。其它定義在整篇詳述中闡述。
[0019] 術(shù)語(yǔ)"抗體"是指完整抗體和任何抗原結(jié)合片段。術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合多肽"和"免疫 結(jié)合劑"在本文中同時(shí)使用。"抗體"是指任選糖基化的包含通過(guò)二硫鍵相互連接的至少兩 個(gè)重（H)鏈和兩個(gè)輕（L)鏈的蛋白質(zhì)或其抗原結(jié)合部分。各重鏈包含重鏈可變區(qū)（在本文 中縮寫為％)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，即CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含 輕鏈可變區(qū)（在本文中縮寫為')和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。VH區(qū)和 '區(qū)可進(jìn)一步再分成稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的具有高變性的區(qū)域，其間散布有稱為框架區(qū) (FR)的更保守區(qū)域。各主要由自氨基末端至羧基末端按以下順序排列的三個(gè)⑶R 和四個(gè)？1?組成疋1?1、0)1?1、？1?2、0)1?2、？1?3、0)1?3、？1?4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相 互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白結(jié)合宿主組織或因子，包括免疫系 統(tǒng)的各種細(xì)胞（例如效應(yīng)細(xì)胞）和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分（Clq)。
[0020] 術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"（或簡(jiǎn)稱為"抗體部分"）是指一個(gè)或多個(gè)保留特異 性結(jié)合抗原（例如TNF)的能力的抗體片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗體的 片段來(lái)執(zhí)行。涵蓋在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)的結(jié)合片段的實(shí)例包括（i)Fab片段， 即由\、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；（ii)F(ab'）2片段，即包含兩個(gè)由鉸鏈區(qū)處的 二硫橋連接的Fab片段的二價(jià)片段；（iii)由V#PCH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；（iv)由抗體 的單臂的八和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；（v)單結(jié)構(gòu)域或dAb片段（Ward等，（1989)Nature 341:544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；以及（vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)或（vii)兩個(gè)或更 多個(gè)可任選由合成接頭接合的分離的CDR的組合。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域'和Vh 是由單獨(dú)基因編碼，但它們可使用重組方法由使得它們能夠制備成其中'區(qū)和VHg成對(duì)以 形成單價(jià)分子（稱為單鏈Fv(scFv);參見(jiàn)例如Bird等（1988)Science242:423-426;以及 Huston等（1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)的單一蛋白質(zhì)鏈的合成接頭加 以接合。所述單鏈抗體也意圖涵蓋在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。這些抗體片段是使 用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且篩選以與完整抗體相同的方式發(fā)揮效用的 片段?？赏ㄟ^(guò)重組DNA技術(shù)，或通過(guò)酶促或化學(xué)裂解完整免疫球蛋白來(lái)產(chǎn)生抗原結(jié)合部分。 抗體可具有不同同種型，例如IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型）、IgAl、IgA2、IgD、 IgE或IgM抗體。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"免疫結(jié)合劑"是指含有抗體的全部或一部分抗原結(jié)合位點(diǎn)，例如全部或部 分重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，以使免疫結(jié)合劑特異性識(shí)別靶標(biāo)抗原的分子。免疫結(jié)合劑 的非限制性實(shí)例包括全長(zhǎng)免疫球蛋白分子和scFv、以及抗體片段，包括但不限于（i)Fab片 段，即由VH、（^和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；（ii)F(ab'）2片段，即包含兩個(gè)由鉸鏈區(qū) 處的二硫橋連接的Fab片段的二價(jià)片段；（iii)Fab'片段，其基本上是具有一部分鉸鏈區(qū)的 Fab(參見(jiàn)FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul編，第 3 版 1993)); (iv)由 ％和CH1 結(jié)構(gòu)域組 成的Fd片段；(v)由抗體的單臂的'和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(vi)單結(jié)構(gòu)域抗體，如由 VH或八結(jié)構(gòu)域組成的Dab片段（Ward等，（1989)Nature341:544-546)、駱駝科抗體（參見(jiàn) Hamers-Casterman,等，Nature363:446-448(1993);以及Dumoulin,等，ProteinScience 11:500-515(2002))或鯊魚抗體（例如鯊魚Ig-NARNanobodies? );以及（vii)納米抗 體，即含有單一可變結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。
[0022] 術(shù)語(yǔ)"單鏈抗體"、"單鏈Fv"或"scFv"是指包含由接頭連接的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu) 域（或區(qū)域；VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（或區(qū)域；')的分子。所述scFv分子可具有一般 性結(jié)構(gòu)：NH2-Vf接頭-Vh-COOH或NH2-Vh-接頭-VfCOOH。適合現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)接頭由重復(fù)GGGGS氨基酸序列或其變體組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用具有SEQIDN0:8中闡 述的氨基酸序列的（GGGGS)4接頭，但具有