基因工程酵母的制作方法
【專利說明】基因工程酵母
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程酵母和它們?cè)谏a(chǎn)3-羥基丙酸（3HP)的方法中的用途。
[0002] 3HP是一種平臺(tái)化合物，其可轉(zhuǎn)化成丙烯酸、1，3-丙二醇、丙二酸和其他有價(jià)值的 產(chǎn)品。源自丙烯酸的產(chǎn)品包括用于嬰兒尿布和失禁產(chǎn)品、各種塑料、涂料、粘合劑、彈性體和 油漆中的超強(qiáng)吸收性聚合物。目前，丙烯酸來自丙烯，丙烯是乙烯和汽油生產(chǎn)中的一種副產(chǎn) 物。從葡萄糖或其他可再生碳源建立3HP生產(chǎn)將針對(duì)從化石資源的丙烯酸生產(chǎn)提供生物可 持續(xù)的替代方案。已經(jīng)描述了幾種從葡萄糖生產(chǎn)3HP的方法。但是，具體的教導(dǎo)主要使用 細(xì)菌大腸桿菌作為宿主。本發(fā)明使用酵母作為生產(chǎn)3HP的宿主。這使得能夠在低pH下進(jìn) 行該過程并且因此使該過程總體更經(jīng)濟(jì)。
[0003] US2010/0136638大體描述了在包括酵母的微生物中通過生物催化從0 -丙氨酸 生產(chǎn)3-HP。據(jù)稱丙氨酸可在細(xì)胞中利用具有丙氨酸2, 3-氨基變位酶活性的酶由a-丙 氨酸合成，并且給出了相關(guān)酶的序列。
[0004] 也公開了使用0 -丙氨酸/丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（BAPAT)序列由0 -丙氨酸生產(chǎn)3-HP 的方法。公開了具有BAPAT活性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其使得細(xì)胞能夠?qū)⒈彼嵬ㄟ^丙二酸半 醛中間體轉(zhuǎn)化成3-HP。
[0005] 盡管提到了在酵母中進(jìn)行這種工作的可能性，但并沒有實(shí)踐證據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)，在 大腸桿菌中有效的該通路中的酶在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)中是無效的。 尤其是，根據(jù)US2010/0136638,具有BAPAT活性的酶可獲得自惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)或銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)。但是，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)編碼這些酶的 基因在釀酒酵母中是無效的。
[0006] 丙二酸半醛（或丙二酸半醛或3-氧代丙酸）是產(chǎn)生3HP的一個(gè)通路中的關(guān)鍵中 間體，但是可能有許多生產(chǎn)3HP的不同路徑。
[0007] US2012135481描述了酵母中的包括編碼gabT、3-HPDH和HIBADH基因和其他基因 的3HP產(chǎn)生通路。但是，需要其他的和更好的生產(chǎn)3HP的酵母。
[0008] 我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)異源表達(dá)來自賭狀芽孢桿菌（Bacillus cereus)AH1272的未表 征的轉(zhuǎn)氨酶yhxA時(shí)，在酵母釀酒酵母中獲得了由|3 -丙氨酸生產(chǎn)的3HP。所述yhxA編碼的 轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列列于SEQ ID N01中，并且DNA序列列于SEQ ID N02中。SEQ ID N02 針對(duì)釀酒酵母進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。
[0009] 我們認(rèn)為，來自蠟狀芽孢桿菌AH1272的所述轉(zhuǎn)氨酶YhxA催化0 -丙氨酸和丙酮 酸之間的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，產(chǎn)生L-丙氨酸和丙二酸半醛，在這種情況下，酶應(yīng)該是0 -丙氨 酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶 E. C. 2. 6. 1. 18 (BAPAT)，而不是 gabT (E. C. 2. 6. 1. 19)。
[0010] US2012/0135481大體公開了一種基因修飾酵母細(xì)胞，其包含包括BAAT基因（0丙 氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶-EC 2. 6. 1. 19)的活性3-HP發(fā)酵通路，BAAT基因催化[0 ]-丙氨酸轉(zhuǎn)化 成丙二酸半醛。所以，這里的BAAT與天然存在的或基因修飾的gabT同義。但是，并未表明 通過該方法成功生產(chǎn)了 3-HP。
[0011] W02005/118719公開了在酵母細(xì)胞中使用來自任何生物體的0-丙氨酸/丙酮酸 轉(zhuǎn)氨酶（BAPAT)序列由0 -丙氨酸生產(chǎn)3-HP的方法，但是并未表明該方法的有效性。這里， 經(jīng)鑒定的BAPAT的來源包括假單胞菌、擬南芥、大鼠和非洲爪蟾。如上所述，我們已經(jīng)確認(rèn)， 來自假單胞菌的BAPAT基因在釀酒酵母中是無效的。
[0012] yhxA的Uniprot條目提供了序列，但并未將該酶鑒定為BAPAT。
[0013] 因此，本發(fā)明現(xiàn)在提供了基因修飾酵母細(xì)胞，其包含生產(chǎn)3-HP的活性發(fā)酵通路， 其中，所述細(xì)胞包含并表達(dá)編碼用于產(chǎn)生酶的外源性基因，所述酶與SEQ ID N0 :1具有至少 80%的同一性并催化0 -丙氨酸和丙酮酸之間的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)以產(chǎn)生丙二酸半醛。
[0014] 優(yōu)選地，所述酵母也表達(dá)3-羥基異丁酸脫氫酶（HIBADH)和/或3-羥基丙酸脫氫 酶（3-HPDH)，3-羥基異丁酸脫氫酶適當(dāng)?shù)貋碜糟~綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、 惡臭假單胞菌（P.putida)、賭狀芽孢桿菌（Bacillus cereus)或白色念珠菌（Candida albicans)，3_羥基丙酸脫氫酶任選地來自勤奮生金球菌（Metallosphaera sedula)、頭寇 15硫化葉菌（Sulfolobus tokadaii)或大腸桿菌（E.coli)。
[0015] 為了能夠直接從葡萄糖合成3-羥基丙酸，優(yōu)選另外重新構(gòu)建從丙氨酸至 3-羥基丙酸的通路以表達(dá)異源天冬氨酸1-脫羧酶，優(yōu)選以昆蟲合成，優(yōu)選以紅色面粉甲蟲 (赤擬谷盜（Tribolium castaneum))合成。為了進(jìn)一步增加朝著3-羥基丙酸的流量，優(yōu)選 過表達(dá)丙酮酸羧化酶和/或PEP羧化酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。另外，缺失丙酮酸脫羧酶活性 (PDC1、H)C5、PDC6)或乙醇脫氫酶（ADH)活性會(huì)使得進(jìn)行厭氧發(fā)酵而不形成作為副產(chǎn)物的 乙醇。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的菌株可使用適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化方法進(jìn)化，以改善葡萄糖耐受、去除 乙酸酯依賴性并增加3HP的生產(chǎn)。
[0017]酵母優(yōu)選是釀酒酵母，但可以是克魯弗酵母（Saccharomyces kluyveri)、解脂耶 氏酵母（Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、漢遜德巴 利酵母（Debaryomyces hansenii)、產(chǎn)版假絲酵母（Cyberlindnera jadinii)、小紅酵母 (Rhodotula minuta)、粘紅酵母（Rhodotula glutinis)、戴耳克氏圓抱酵母（Torulaspora delbrueckii)、樹干畢赤酵母（Pichia stipitis)、巴斯德畢赤氏酵母（Pichia pastoris)、 乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus)或其他酵母。
[0018] 適于根據(jù)本發(fā)明修飾的酵母菌株可根據(jù)它們對(duì)于在存在3HP的情況下的生長(zhǎng)的 耐受來選擇。
[0019] 可對(duì)蠟狀芽孢桿菌AH1272的天然（native) yhxA表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列和編碼它 的DNA序列進(jìn)行修飾，以各種方式在本發(fā)明中使用。首先，DNA序列可進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用 于在適當(dāng)?shù)慕湍钢斜磉_(dá)。第二，可通過氨基酸的缺失、添加或置換對(duì)氨基酸序列進(jìn)行修飾， 而不干擾、或者實(shí)際上增加酶的活性。這種經(jīng)修飾的酶可與天然氨基酸序列具有至少80% 的同源性，更優(yōu)選至少85 %、或90 %或95 %的同源性。
[0020] 本發(fā)明包括生產(chǎn)3HP的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明的酵母細(xì)胞和任選地從培養(yǎng)物回 收3HP。培養(yǎng)可在包括丙氨酸或除所述酵母之外的丙氨酸來源的培養(yǎng)基中進(jìn)行。 所述來源可以是另一微生物。但是，本發(fā)明的酵母可被工程化以生產(chǎn)丙氨酸，例如，適 當(dāng)?shù)赝ㄟ^組入產(chǎn)生天冬氨酸-1-脫羧酶（EC 4. 1. 1. 11)或谷氨酸脫羧酶（EC 4. 1. 1. 15)的 外源性基因從L-天冬氨酸生產(chǎn)0 -丙氨酸，或利用2, 3-丙氨酸氨基變位酶由L-丙氨酸生 產(chǎn)丙氨酸。由于其在合成泛酸酯中的作用，天冬氨酸1-脫羧酶也稱為PanD。野生型釀 酒酵母的基因組中不存在該酶的基因。
[0021] 我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用某些編碼天冬氨酸-1-脫羧酶的外源性PanD基因相比其他基 因可獲得優(yōu)異的結(jié)果。尤其，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自昆蟲、尤其面粉甲蟲、更尤其紅色面粉甲蟲 (Tribolium castaneum，赤擬谷盜）的PanD基因，與細(xì)菌PanD基因相比，提供3-HP的更好 的生產(chǎn)滴度和更好的產(chǎn)率。
[0022] 優(yōu)選地，通過所述酵母生產(chǎn)3HP的產(chǎn)量為，由每升培養(yǎng)基生產(chǎn)、或從每升所述培養(yǎng) 基回收至少l〇〇mg 3HP，更優(yōu)選至少200、或300、或400或500或1000或2000或14000mg/ 1〇
[0023] 在下述非限制性實(shí)施例中進(jìn)一步描述和闡釋本發(fā)明，其中，參考了下表。
[0024] 表1.引物
[0026] 表2.中間質(zhì)粒
[0027]
[0028] 表3.用于通過PCR產(chǎn)生USER克隆的基因片段的引物和模板
[0031] 表4?表達(dá)質(zhì)粒
[0033]
[0034] *pTY為通過靶向TY重復(fù)區(qū)域多重整合入染色體而設(shè)計(jì)的載體。該載體包含與表 4中列舉的其他親本質(zhì)粒相同的USER克隆盒。
[0035] 表5.添加了 0-丙氨酸的培養(yǎng)中的菌株和3HP滴度