液濃縮后通過硅膠柱 層析（石油醚：氯仿-2:3)濃縮結晶得到反應物C。收率為90. 9%。將2mg反應物C與25mg KOH，IOmL DMSO作為反應物，置于干燥的圓底燒瓶中，混合均勻后加入IOmL四氫呋喃，30°C 條件下加熱回流4h，反應完畢后將全部反應液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱層析（石油醚： 氯仿-2:3)濃縮結晶得到目標產(chǎn)物CLCN。收率為91.0%。分子式為：C 26H25O5N5;相對分子量 為：487. 64。
[0025] 實施例2 稱取4mg甘草素溶于4mL二氯甲烷溶液中，加入ImL四溴化碳，然后在冰浴中緩慢滴加 ImL三苯基磷的二氯甲烷溶液，反應完畢后將反應液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱層析（石 油醚：氯仿-2:3)濃縮結晶得到反應物A，收率為86. 8%。稱取2mg反應物A與8mg Κ0Η， 將其置于干燥的圓底燒瓶中，加入5mL四氫呋喃，70°C條件下回流5h，反應完畢后冷卻至室 溫，加入對20mL甲基苯磺酰氯反應6h，收集反應液，旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑四氫呋喃，加水 溶解后過濾收集濾渣，干燥結晶，得到反應物B。收率為88. 5%。稱取IOmg反應物B與18mg 蟲草素，將其置于干燥的圓底燒瓶中，加入1等當量的CuI為催化劑，加入20mL二甲基甲 酰胺溶液，在45°C條件下回流10h，反應完畢后將全部反應液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱 層析（石油醚：氯仿-2:3)濃縮結晶得到反應物C。收率為90. 1%。將2mg反應物C與25mg KOH，IOmL DMSO作為反應物，置于干燥的圓底燒瓶中，混合均勻后加入IOmL四氫呋喃，30°C 條件下加熱回流8h，反應完畢后將全部反應液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱層析（石油醚： 氯仿-2:3)濃縮結晶得到目標產(chǎn)物CLCN。收率為91. 2%。分子式為：C26H25O5N5;相對分子量 為：487. 64。
[0026] 實施例3 稱取5mg甘草素溶于6mL二氯甲烷溶液中，加入2mL四溴化碳，然后在冰浴中緩慢滴加 2mL三苯基磷的二氯甲烷溶液，反應完畢后將反應液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱層析（石 油醚：氯仿-2:3)濃縮結晶得到反應物A，收率為88. 1%。稱取2mg反應物A與8mg Κ0Η， 將其置于干燥的圓底燒瓶中，加入8mL四氫呋喃，90°C條件下回流4h，反應完畢后冷卻至室 溫，加入對20mL甲基苯磺酰氯反應6h，收集反應液，旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑四氫呋喃，加水 溶解后過濾收集濾渣，干燥結晶，得到反應物B。收率為88. 9%。稱取IOmg反應物B與18mg 蟲草素，將其置于干燥的圓底燒瓶中，加入1等當量的CuI為催化劑，加入20mL二甲基甲 酰胺溶液，在45°C條件下回流12h，反應完畢后將全部反應液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱 層析（石油醚：氯仿-2:3)濃縮結晶得到反應物C。收率為91. 1%。將2mg反應物C與25mg KOH，IOmL DMSO作為反應物，置于干燥的圓底燒瓶中，混合均勻后加入IOmL四氫呋喃，30°C 條件下加熱回流6h，反應完畢后將全部反應液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱層析（石油醚： 氯仿-2:3)濃縮結晶得到目標產(chǎn)物CLCN。收率為90. 2%。分子式為：C26H25O5N5;相對分子量 為：487. 64。
[0027] 以下試驗表明本發(fā)明合成化合物CLCN的抗肝癌效果 試驗例1 本發(fā)明合成化合物CLCN對肝癌細胞PLC/PRL/5和H印G2生長的抑制作用 ①取處于對數(shù)生長期的PLC/PRL/5和H印G2細胞一瓶，用胰蛋白酶消化，制成I X 104 個/ml的細胞懸液。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0028] ②移去培養(yǎng)基，按照濃度梯度加入該化合物，每孔100 μ L，另設空白對照組。每組 設4個復孔。藥物作用24h后，加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)。
[0029] ③棄去96孔板內(nèi)上清液，每孔加入100 μ L的DMS0,震蕩20min，于540nm波長處 測定各孔光吸收值（0D值)，計算細胞的存活率：存活率（％)=(用藥組平均OD值+空白對 照組平均OD值）X 100%。
[0030] 試驗結果 0、12· 5、25、50、100、200 μΜ CLCN 處理PLC/PRL/5和！fepG2細胞24小時及48小時后， 細胞活性顯著降低。結果見圖1。
[0031] 結論：CLCN對肝癌細胞PLC/PRL/5和H印G2均具有不同程度的增殖抑制作用，并 呈劑量依賴性。
[0032] 試驗例2 本發(fā)明合成化合物CLCN在異位腫瘤小鼠模型中對腫瘤生長的抑制作用 ①動物：BALB/c無胸腺裸鼠，雄性，4-5周齡，重量18g-25g，由北京維通利華實驗動物 技術有限公司提供。動物分籠飼養(yǎng)，食水自由，保持在23±1°C下12h光暗周期條件下生長。
[0033] ②皮下注射PLC/PRL/5細胞懸液（5X 10個/ml)到無胸腺裸鼠中。4-6天后，當腫 瘤的最大直徑為2-3mm，將小鼠分為兩組，實驗組每隔2天隨機腹腔注射20mg/kg CLCN，對 照組每隔2天隨機腹腔注射20mg/kg PBS 14天。
[0034] ③每隔2天用游標卡尺測量腫瘤長徑a和短徑b，利用公式：V=a*b~2/2計算腫瘤 大小。實驗結束時用200mg/kg戊巴比妥處死動物并對腫瘤進行仔細解剖。
[0035] 試驗結果 用2〇11^/1^(：^^處理的小鼠腫瘤大小僅增長了38.3±6.6倍，和用？85處理的小鼠 89. 6±6. 3倍相比顯著減?。≒〈0. 05)。用20mg/kgCLCN處理的小鼠體重和用PBS處理的小 鼠體重相比沒有顯著不同。結果見圖2。
[0036] 結論：CLCN對異位腫瘤小鼠模型的實體瘤的生長起抑制作用。
[0037] 試驗例3 本發(fā)明合成化合物CLCN對肝癌細胞PLC/PRL/5和H印G2中細胞凋亡相關蛋白的作用 ① 收集細胞裂解物用12%SDS-PAGE凝膠分離并轉移電泳到硝酸纖維素膜。該轉印膜 上，然后用下面的印跡抗磷酸化（P)的第一抗體和總蛋白（T)，4°C過夜，稀釋度1:1000 : p-ERKs, T-ERKs, p-mTOR, T-mTOR, p-JNK, T-JNK, p-P38, T-P38, GADPH. ② 其次是與辣根過氧化物酶標記的二抗體孵化，用ECL化學發(fā)光檢測試劑盒檢測。該 頻段的強度量化通過掃描光密度測定用軟件Quantity One-4. 5.0定量。
[0038] 試驗結果 在PLC/PRF/5以及H印G2細胞中CLCN均在0. 5h最早開始抑制ERKs的磷酸化，在PLC/ PRF/5中Ih時抑制效果達到頂峰，在H印G2細胞中12h抑制效果達到頂峰。在PLC/PRF/5 以及H印G2細胞中CLCN抑制mTOR磷酸化活性。但對P38和JNK幾乎沒有任何影響。結果 見圖3。
[0039] 結論：本發(fā)明CLCN的抗肝癌效果通過抑制mTOR及ERKs活性實現(xiàn)。
【主權項】
1. 一種定向合成化合物CLCN，具有以下結構式：其化學名稱為：CLCN ;分子式為：C26H2505N5;相對分子量為：487. 64。2. 如權利要求1所述的定向合成化合物CLCN的合成方法的制備步驟如下： ① 將2-6 mg甘草素溶于3-6mL二氯甲烷溶液中，加入1-2 mL四溴化碳，然后在冰浴 中緩慢滴加1-2 mL三苯基磷的二氯甲烷溶液，反應完畢后將反應液過濾，濾液濃縮后通過 硅膠柱層析（石油醚：氯仿-2:3)濃縮結晶得到反應物A ; ② 以反應物A與KOH作為反應物(原料比為1:1-1 :2)，5-10 mL四氫呋喃作為溶劑， 70-90°C回流溫度下攪拌4-8h，反應完畢后冷卻至室溫，加入對甲基苯磺酰氯反應6h，收集 反應液，旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑四氫呋喃，加水溶解后過濾收集濾渣，干燥結晶，得到反應 物B ; ③ 以反應物B和蟲草素為原料(原料比為I :1-1 :1. 5)，1等當量的CuI為催化劑，以 20 mL二甲基甲酰胺溶液或鄰二氯苯溶液中任意一種或兩種為溶劑，在30-45°C回流溫度 條件下攪拌6-12h，反應完畢后將全部反應液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱層析（石油醚： 氯仿-2:3)濃縮結晶得到反應物C ; ④ 將反應物C與KOH原料(原料比為1:1-1 :1. 5)，10 mL DMSO作為反應物，10 mL四 氫呋喃作為溶劑，加熱回流4-8h,反應完畢后將全部反應液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱 層析（石油醚：氯仿-2:3)濃縮結晶得到目標產(chǎn)物CLCN。3. 如權利要求1所述的定向合成化合物CLCN在制備抗肝癌藥物上的應用。4. 如權利要求1所述的定向合成化合物CLCN制成的藥物制劑為醫(yī)藥學上的任何藥物 劑型。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種定向合成化合物CLCN，還進一步提供了該化合物在抗肝癌藥物中的應用，以蟲草素和甘草素為原料定向合成新產(chǎn)物CLCN，可以將該化合物作為藥效活性成分制備成的抗肝癌的藥劑。該藥物用于治療肝癌，具有抗癌效果顯著，見效快，副作用小等特點，是優(yōu)良的抗肝癌候選藥物。
【IPC分類】C07H1/00, A61P35/00, C07H19/16
【公開號】CN104892707
【申請?zhí)枴緾N201510320072
【發(fā)明人】王迪, 逯家輝, 周毓麟, 孟慶繁, 滕利榮, 張洋, 孟令軍, 權宇彤, 姜丹
【申請人】吉林大學
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月11日