RE蛋白的參與，它能夠介 導(dǎo)突觸小泡與神經(jīng)元細(xì)胞膜的融合。
[0017] SNARE復(fù)合體蛋白參與突觸小泡上質(zhì)膜融合，而肉毒毒素輕鏈的作用是阻礙胞吐 作用。更具體地說，就是在肌肉接頭處，神經(jīng)毒素通過切割SNARE蛋白（乙酰膽堿分子胞吐 作用所必須的物質(zhì)）阻斷了囊泡內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，抑制乙酰膽堿的釋放，從而抑 制神經(jīng)傳遞。據(jù)證實(shí)，單獨(dú)的SNARE蛋白裂解不會妨礙SNARE復(fù)合體形成，但是卻會導(dǎo)致非 功能性復(fù)合物在Ca 2+內(nèi)流和融合之間的耦合被破壞。毒素在抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放時，需要Ca2+ 的參與，而在突觸末梢Ca 2+濃度增加會影響肉毒毒素的作用效果。
[0018] 輕鏈作為鋅肽鏈內(nèi)切酶蛋白切割致使SNARE復(fù)合物不穩(wěn)定，成為非功能性，從而 抑制乙酰膽堿釋放到突觸間隙。囊泡釋放到突觸間隙的數(shù)量越少，動作電位傳播的概率就 越低，從而引起肌肉纖維的收縮。結(jié)果導(dǎo)致肌肉自身的化學(xué)去神經(jīng)術(shù)而引起弛緩性麻痹?，F(xiàn) 有研宄表明SNARE復(fù)合物由VAMP、SNAP-25和syntaxin三種蛋白質(zhì)組成，下表所示為不同 類型的肉毒毒素的靶蛋白及其切割位點(diǎn)。
[0019] 噬菌體展示技術(shù)的基本原理是把外源DNA插入噬菌體編碼外殼蛋白pin或 PVIiI的基因中，使外源DNA片斷對應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的外殼蛋白中形成融合蛋 白（fusion protein)，呈現(xiàn)在噬菌體表面。噬菌體展示技術(shù)的顯著優(yōu)點(diǎn)是：建立了基因型 (genotype)和表型（phenotype)之間直接的物理聯(lián)系，從而使篩選簡便高效。將外源蛋 白或多肽表達(dá)于噬菌體表面，就可根據(jù)其性質(zhì)利用它與其他生物或非生物物質(zhì)的親和性對 含目的基因的菌體進(jìn)行篩選。以菌體抗體庫的篩選為例，將Fab (fragment antigen binding)表達(dá)在菌體表面，以相應(yīng)的抗原為親和性配體篩選，可以快速高效地從大量克 隆中篩選表達(dá)特異性抗體的噬菌體。因此，用噬菌體展示技術(shù)制備高親和性抗體與傳統(tǒng)的 雜交瘤單克隆抗體技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢。
[0020] 噬菌體抗體在膜表面表達(dá)，是通過Fab段或ScFv與單鏈?zhǔn)删w外殼蛋白形成融 合蛋白而完成。其特點(diǎn)是"它既可識別相應(yīng)的抗原并與其結(jié)合，又能夠感染宿主菌進(jìn)行再 擴(kuò)增"。利用其可再擴(kuò)增的特性，以靶抗原通過親和吸附-洗脫-擴(kuò)增，可篩選到靶分子的配 體肽鏈。再經(jīng)突變和鏈置換方法改進(jìn)抗體親和力，最終便獲得高親和力的特異性抗體。噬 菌體抗體庫的篩選包括兩個主要步驟：淘篩和鑒定。淘篩是將噬菌體抗體庫與選擇用的抗 原共同孵育，通過幾輪洗脫，收集結(jié)合的噬菌體。將獲得的噬菌體感染細(xì)菌并擴(kuò)增，再進(jìn)行 下一輪的淘篩。經(jīng)幾輪淘篩后，便可富集到與抗原特異性結(jié)合的噬菌體感染的多克隆菌株。 鑒定過程是從噬菌體感染的多克隆菌株中挑選出單克隆菌株。即將淘篩出的噬菌體感染細(xì) 菌、鋪板、挑選，即可得到高特異性單克隆菌株。
[0021] 從噬菌體抗體庫中篩選表達(dá)特異性抗體的噬菌體的經(jīng)典方法主要有兩種：（1)將 純抗原包被在固相介質(zhì)上，如酶標(biāo)板、免疫試管或親和層析柱，然后加入待篩選的噬菌體， 洗去非親和性或低親和性的噬菌體，回收高親和性的噬菌體。（2)將抗原與生物素基團(tuán)相 連，再將其固定在包被有streptavidin的順磁珠上對菌體進(jìn)行篩選。兩種方法中均需加 脫脂牛奶（或BSA，其效果較差）封閉未被抗原占據(jù)的位點(diǎn)，以避免噬菌體非特異性的結(jié)合。 對于前一方法，回收與抗原特異性結(jié)合的噬菌體可用堿性溶液（如三乙基胺，（triethy- Iamine)或酸性溶液（如甘氨酸一鹽酸，glycine_HCl)洗脫，或用可溶的抗原或半抗原洗 脫；對于后一方法，用二巰基蘇糖醇（dithiothretOl，DTT)通過破壞抗原與生物素之間的 二硫鍵來洗脫?；厥盏氖删w感染宿主菌，增殖后進(jìn)行下一輪篩選。一般經(jīng)過3-5輪這樣 的篩選可得到表達(dá)高親和性的目的抗體的克隆。每一輪篩選都需要進(jìn)行檢測，以證實(shí)篩選 的有效性。
[0022] 英國 MRC HGMP 資源中心創(chuàng)建的 Human Single Fold scFv Libraries I+J ( Tomlinson I + J)是當(dāng)今成熟的全人源噬菌體抗體庫，其庫容超過IO8全人源噬菌體單鏈 抗體，本研宄利用該噬菌體庫淘選特異性抗B型肉毒毒素單鏈抗體，并對陽性單鏈抗體進(jìn) 行系統(tǒng)分析，以期創(chuàng)制B型肉毒毒素中毒治療抗體類藥物奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0023] 本發(fā)明人通過對肉毒毒素的作用機(jī)理的了解及研宄，確定肉毒毒素能夠引起人畜 共患病，且主要攻擊體內(nèi)的神經(jīng)突觸系統(tǒng)，其致病機(jī)理為，肉毒毒素通過其重鏈C端結(jié)構(gòu)域 結(jié)合于膽堿能神經(jīng)元的突觸前膜，形成毒素受體復(fù)合物內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞囊泡，然后輕鏈鋅內(nèi) 肽酶酶活性區(qū)從細(xì)胞內(nèi)的酸性空間釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。一旦從囊泡中釋放出來，輕鏈通過切 害J SNARE復(fù)合物蛋白來阻止乙酰膽堿的釋放，引起肌肉麻痹。因此輕鏈為主要的致病部位。 目前，國內(nèi)外關(guān)于A型肉毒毒素的報道已相對比較全面，但關(guān)于B型肉毒毒素的研宄報道相 對較少，同時缺乏B型肉毒毒素治療方法和藥物，這樣就造成了一旦有人罹患B型肉毒中 毒，將無法及時進(jìn)行正確治療的境況?？贵w是治療肉毒中毒最有效的方法，但目前研宄或有 限使用的異源性血清抗體存在著許多缺點(diǎn)，如引起免疫反應(yīng)或傳染疾病等，導(dǎo)致無法推廣 應(yīng)用。由于此類抗體分子量較大，難于穿透細(xì)胞膜，針對已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞的毒素輕鏈則無治療 效果，因此本發(fā)明旨在克隆表達(dá)B型肉毒毒素，通過重組蛋白在人源化抗體庫中篩選中和 性人源化單鏈抗體，為研制抗B型肉毒毒素特效救治藥物及快速檢測B型肉毒毒素奠定基 礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 本發(fā)明的目的是為解決異源性血清抗體在治療B型肉毒毒素中毒，存在引起免疫 反應(yīng)或傳染疾病的問題，而提供一種全人源的單鏈抗體ScFv，抗B型肉毒毒素酶活性的人 源單鏈抗體2F-scFv。
[0025] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-scFV，其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。
[0026] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-SCFv，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 8所示。
[0027] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-SCFv在生產(chǎn)治療B型肉毒毒素酶中毒 藥物方面的應(yīng)用。
[0028] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F_scFv在檢測B型肉毒毒素方面的應(yīng) 用。
[0029] 本發(fā)明提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-scFV，它是利用 人工合成的重組蛋白BontB，及篩選抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體的底物 GFP-HIS6-SNAP25 (62)-VAMP (57)-C，人源化抗B型肉毒毒素酶活性抗體庫中篩選出來的， 親和常數(shù)為（5. 35±0. 903) X 105L/mol，為生產(chǎn)抗B型肉毒毒素特效救治藥物及快速檢測 B型肉毒毒素奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0030] 圖1為雙酶切pMD-IOT-Bont-B質(zhì)粒電泳結(jié)果；I. EcoR I和Nde I雙酶切質(zhì)粒 pMD-19T-Bont-B ； 2. DNA marker DL2000〇
[0031] 圖 2 為 PCR 鑒定重組質(zhì)粒 PET-28a-BontB 結(jié)果圖；I. DNA marker DL2000 ; 2. 3. 4.均為BontB區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0032] 圖3為雙酶切重組質(zhì)粒PET-28a-BontB鑒定結(jié)果；其中：1· 2.均為EcoR I和 Nde I 雙酶切質(zhì)粒 PET-28a-BontB 3. DNA marker DL2000 ; 圖4為重組蛋白表達(dá)形式鑒定其中：1.未誘導(dǎo)菌超聲沉淀；2.誘導(dǎo)菌超聲沉淀；3.未 誘導(dǎo)菌超聲上清；4.誘導(dǎo)菌超聲上清國5:誘導(dǎo)的全菌體；6.蛋白質(zhì)Marker ; 圖5為重組蛋白SDS-PAGE結(jié)果分析；其中：1.蛋白質(zhì)marker ;2.初步純化的目的蛋 白；3.最終純化的目的蛋白； 圖6重組質(zhì)粒PET-28a -GFP的雙酶切鑒定（NcoI和BamHI);其中1:質(zhì)粒PET_28a -GFP 的雙酶切產(chǎn)物；M : DNA marker DL2000 ; 圖 7 質(zhì)粒 PET-28a-GFP-SV 的雙酶切產(chǎn)物；M :DNA marker DL5000 ; 圖8純化后2F-scFv SDS-PAGE結(jié)果分析；I:流穿2:55%硫酸銨原樣3:純化后scFv。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1:B型肉毒毒素輕鏈基因的合成 根據(jù)Genbank報道的B型肉毒毒素全基因序列，設(shè)計(jì)并合成輕鏈基因，同時插入EcoRI 和恥6 1酶切位點(diǎn)，將基因片段克隆入？1?-191'仰(^〇1'，轉(zhuǎn)化入舅109中。
[0034] 實(shí)施例2:B型肉毒毒素輕鏈基因與PET_28a載體連接 利用內(nèi)切酶EcoR 1和Nde I雙酶切質(zhì)粒pMD-19T-Bont-B，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 分析，結(jié)果見圖2所示，可見到大小約為1335的目的基因 BontB，與預(yù)期的大小相符； 將EcoRI和Nde I雙酶切的載體PET-28a大片段與目的基因 BontB小片段回收，并用T4 DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒PET-28a-BontB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，含kan抗 性的瓊脂糖平板進(jìn)行初步篩選。挑選單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；用質(zhì)?；厥赵噭┖刑?取質(zhì)粒。
[0035] 通過合成插入EcoRI和Nde I酶切位點(diǎn)的B型肉毒毒素輕鏈基因序列，為其設(shè)計(jì)引 物，上游引物標(biāo)為Pl，下游引物標(biāo)為P2。
[0036] Pl (23bp) :5' CATATgCCAgTTACAATAAATAA-3' P2 (23bp) :5' gAATTCTCATTTAACACTTTTAC-3' 以重組質(zhì)粒PET-28a-BontB為模板，Pl和P2為引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到的PCR產(chǎn)物， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，（見圖3); 用限制性內(nèi)切酶和EcoR I和Nde I進(jìn)行雙酶切鑒定，并進(jìn)行序列的測定?？梢娰|(zhì)粒經(jīng) 雙酶切后，PCR擴(kuò)增目的條帶后，在1335bp上均有目的基因帶(見圖4)，證明目的基因 BontB 基因已經(jīng)連接到載體上，成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒PET-28a-BontB。
[0037] 實(shí)施例3:重組蛋白PET-28a-BontB表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果分析 將重組質(zhì)粒PET-2