表面帶正電荷具有聚集誘導(dǎo)熒光增強性質(zhì)的熒光納米微球及其生物應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表面帶正電荷具有聚集誘導(dǎo)熒光增強性質(zhì)的熒光納米微球及其在細(xì)胞成像和生物檢測等方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物成像是一個集合多種技術(shù)、交融多種學(xué)科、應(yīng)用廣泛、發(fā)展迅速的新興領(lǐng)域。近些年來隨著生物化學(xué)和生命科學(xué)的發(fā)展，人們對生物體的研宄逐漸從宏觀轉(zhuǎn)向了微觀。因此其分支領(lǐng)域之一的生物熒光成像成為人們研宄和關(guān)注的焦點。熒光技術(shù)具有快捷、靈敏、實時、無放射性、重復(fù)性好，多個光物理參量(如發(fā)射波長、激發(fā)波長、熒光強度、熒光壽命)可用于檢測等優(yōu)點。熒光探針是實現(xiàn)生物熒光成像的核心技術(shù)。傳統(tǒng)的熒光探針以有機熒光染料為主，但由于有機熒光染料耐光性差、水溶性差、生物相容性差以及聚集熒光誘導(dǎo)淬滅等缺點，而難以在實際中應(yīng)用。隨著生物熒光成像應(yīng)用的日益廣泛，研發(fā)出新型的熒光探針以克服傳統(tǒng)探針的缺點變得刻不容緩。因此，熒光納米粒子探針作為解決這一問題的有效手段被提出。
[0003]目前焚光納米粒子探針主要包括:量子點(quantum dot, QD)，上轉(zhuǎn)換稀土納米粒子(Upconvers1n Rare Earth Nanoparticles, UCRE-NPs)和高分子焚光納米微球。無機量子點由于熒光效率高被人們廣泛用于生物標(biāo)記等領(lǐng)域，但是研宄發(fā)現(xiàn)當(dāng)無機量子點用于生物成像進(jìn)入生物體內(nèi)時，表面易被體內(nèi)的氧化劑氧化成重金屬離子，因此生物毒性大不宜于生物成像。高分子熒光納米微球開始是以聚苯乙烯、聚丙烯酰胺類、聚甲基丙烯酸酯類為微粒主體，表面鍵合或吸附熒光物質(zhì)的熒光納米微球。因為單個納米粒子可以鍵合多個熒光分子，所以熒光強度有所增強。與小分子的有機染料相比，高分子熒光納米微球通常在水相中分散性良好、熒光發(fā)射強度較強、發(fā)光效率較高的同時，光漂白的現(xiàn)象發(fā)生幾率很低；并且在多種生物環(huán)境之下粒子穩(wěn)定性和生物相容性都很高。所以很多高分子熒光納米微粒無需經(jīng)過繁瑣的改性及改良就可以直接用于生物成像熒光探針、熒光生物傳感器等生物應(yīng)用領(lǐng)域。但目前用于高分子熒光納米微球的大部分熒光分子具有聚集誘導(dǎo)淬滅性質(zhì)。在制備高效率高分子熒光納米微球時熒光染料加入量少時熒光信號不能顯著地提高，但加入量大時由于聚集誘導(dǎo)淬滅效應(yīng)熒光信號也會衰減或沒有熒光發(fā)射，使其應(yīng)用受到限制。
[0004]近年來，具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)的熒光分子受到人們的關(guān)注。它與傳統(tǒng)的熒光分子不同，AIE分子在聚集態(tài)或不良溶劑中熒光會顯著增強，當(dāng)處于自由狀態(tài)時由于分子內(nèi)轉(zhuǎn)動加劇消耗吸收的能量使熒光衰減。但AIE分子多為有機染料小分子，生物相容性差，在血液中循環(huán)時間短不能有效的進(jìn)入細(xì)胞因此不能用于生物成像。因此設(shè)計一個有效載體能實現(xiàn)熒光分子的AIE效應(yīng)并且生物相容性好，生物毒性低，尺寸合適，細(xì)胞穿透性好以及體內(nèi)環(huán)境對其熒光沒有淬滅作用，在生物成像領(lǐng)域是至關(guān)重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種可用于細(xì)胞成像和生物檢測的表面帶正電荷的具有聚集誘導(dǎo)熒光增強性質(zhì)的熒光納米微球。
[0006]本發(fā)明首先合成出一種表面帶正電荷的納米微球乳液，將帶有負(fù)電荷的具有AIE效應(yīng)的熒光分子通過靜電作用力修飾到納米微球表面。熒光分子由于受到庫侖力的作用分子內(nèi)轉(zhuǎn)動受到限制，吸收的能量基本通過熒光輻射釋放出來，因此熒光分子修飾到納米微球上其熒光強度增強百倍，表現(xiàn)出優(yōu)異的AIE性質(zhì)。我們所制得的熒光納米微球熒光性質(zhì)穩(wěn)定，生物相容性好，毒性低，表面帶正電荷易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)行細(xì)胞熒光成像和生物檢測。因此，我們制得的表面帶正電荷的熒光納米微球在細(xì)胞成像等生物領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0007]本發(fā)明所述的表面帶正電荷的具有聚集誘導(dǎo)熒光增強性質(zhì)的熒光納米微球，其由如下步驟制備得到:
[0008](I)量取5?1mL聚合單體I分散于150?200mL的去離子水中，再加入0.04g?0.5g的聚合單體2 ;室溫、氮氣保護(hù)下，機械攪拌(300?600rpm)，除去反應(yīng)體系中的氧氣；升溫至70?90°C后加入1mL含0.3?0.5mmol引發(fā)劑的水溶液于反應(yīng)體系中，氮氣保護(hù)、攪拌下聚合反應(yīng)5?20小時，得到表面帶正電荷的納米微球溶液；高速離心(15000?20000rpm)洗滌除去未反應(yīng)的單體、低聚物、引發(fā)劑等雜質(zhì)，納米微球重新超聲分散于10mL去離子水中；
[0009](2)量取10?20mL步驟⑴所得到的納米微球溶液，加入10?20mL去離子水，然后再加入3?5mL、80?150 μ g/mL的AIE型熒光分子，在50?80°C、氮氣保護(hù)條件下，磁力攪拌反應(yīng)4?1h ;高速離心(15000?20000rpm)除去未復(fù)合的AIE型熒光分子，獲得AIE分子復(fù)合的表面帶正電荷的熒光納米微球；將得到的熒光納米微球分散于去離子水中，從而得到本發(fā)明所述的表面帶正電荷的具有聚集誘導(dǎo)熒光增強性質(zhì)的熒光納米微球。
[0010]上述方法中，聚合單體I是苯乙烯(St)、氟代苯乙烯(F-St)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯、氯乙烯、丙烯酸叔丁酯、二乙烯基苯或α-甲基苯乙烯或甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA);
[0011]上述方法中，聚合單體2是N，N，N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC)，2- ( 二異丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(DPA)或2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽(AMA);
[0012]上述方法中，引發(fā)劑是偶氮二異丁脒鹽酸鹽(V5tl),偶氮二異丁咪唑啉鹽酸鹽(AIBI)，偶氮異丁氰基甲酰胺(V3tl);
[0013]上述方法中，AIE型的熒光分子是9，10- 二(苯乙烯基)蒽磺酸鹽(DSA)、1，2- 二[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]-1，2-二苯基乙烯二鈉鹽(BSTPE)或1，1，2，2-四[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]乙烯四鈉鹽(TSTPE)。
[0014]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0015]1、該熒光納米微球的粒徑在納米級別且尺寸可控(50?140nm)；
[0016]2、該熒光納米微球生物相容性好，在磷酸緩沖溶液和生物大分子溶液中能穩(wěn)定存在3個月以上(圖5);
[0017]3、該熒光分子在pH = 3?7范圍內(nèi)熒光基本穩(wěn)定，在pH = 7?10范圍內(nèi)熒光呈線性降低，但降低程度對熒光成像沒有影響；
[0018]4、該熒光納米微球表面帶正電荷，易于進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞熒光成像和生物檢測。
[0019]5、該焚光納米微球在生物大分子如BSA存在時焚光信號增強，生物大分子可以起到放大熒光信號的作用。并且BSA濃度和熒光強度呈線性變化，因此此材料可用于檢測BSA濃度(圖7)。
[0020]6、該熒光納米微球的細(xì)胞毒性低(圖8)，利于其進(jìn)行生物應(yīng)用。
【附圖說明】
[0021]圖1:為實施例1制備的納米微球掃描電子顯微鏡照片(SEM)；
[0022]圖2:為實施例1制備的納米微球和熒光納米微球動態(tài)光散射粒徑圖；
[0023]圖3:為實施例1制備的納米微球和熒光納米微球動態(tài)光散射Zeta圖；
[0024]圖4:為實施例1制備的熒光納米微球和熒光分子水溶液熒光譜圖(熒光分子濃度相同，入ex = 420nm)；
[0025]圖5:為實施例1制備的熒光納米微球水溶液、熒光納米微球胎牛血清(FBS)磷酸緩沖溶液(pH = 7.4)、3個月后的熒光納米微球胎牛血清(FBS)磷酸緩沖溶液(pH = 7.4)的動態(tài)光散射粒徑圖；
[0026]圖6: (I)為實施例1制備的熒光納米微球在不同PH磷酸緩沖溶液下，熒光納米微球的熒光譜圖；(2)為實施例1制備的熒光納米微球熒光強度與pH關(guān)系圖；
[0027]圖7: (I)為實施例1制備的納米微球在不同BSA濃度下熒光譜圖；⑵為BSA濃度與熒光強度曲線圖；
[0028]圖8: (I)為實施例1熒光納米微球?qū)θ宋刚衬ど掀ぜ?xì)胞(GES-1)的細(xì)胞毒性測試圖；(2)為實施例1熒光納米微球?qū)θ宋赴┘?xì)胞(SGC-7901)的細(xì)胞毒性測試圖；
[0029]圖9: (a)為實施例1制備的納米微球在正常細(xì)胞人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)熒光共聚焦明場照片；(b)為實施例1制備的納米微球在正常細(xì)胞人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)熒光共聚焦明場和暗場疊加照片；(c)為實施例1制備的納米微球在正常細(xì)胞人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)熒光共聚焦暗場照片；(d)為實施例1制備的納米微球在正常細(xì)胞人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)熒光共聚焦明場照片；(e)為實施例1制備的納米微球在人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)熒光共聚焦明場和暗場疊加照片；(f)為實施例1制備的納米微球在人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)熒光共聚焦暗場照片；
[0030]圖10:為實施例2制備的納米微球掃描電子顯微鏡照片(SEM)；
[0031]圖11:為實施例3制備的納米微球掃描電子顯微鏡照片(SEM)；
[0032]圖12:為實施例4制備的納米微球掃描電子顯微鏡照片(SEM)。
【具體實施方式】
[0033]實施例1:
[0034](I)取5mL苯乙烯(分析純，經(jīng)減壓蒸餾除阻聚劑)和0.06g N, N, N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC)加入到含有185mL去離子水的500mL的三頸瓶中，室溫、氮氣保護(hù)下機械攪拌(400rpm)30分鐘，除去反應(yīng)體系中的氧氣，然后升溫到70°C，加入10mL、含有0.37mmol偶氮二異丁脒鹽酸鹽(V5tl)引發(fā)劑的水溶液引發(fā)聚合，聚合在氮氣保護(hù)、400rpm的攪拌速度下進(jìn)行10h。聚合得到的納米微球在18500rpm的轉(zhuǎn)速下離心3次，并用去離子水洗滌3次，除掉未反應(yīng)的單體、低聚物、引發(fā)劑等，重新分散到10mL去離子水中，便制得質(zhì)量濃度為2.92%表面帶正電荷的納米微球溶液。
[0035](2)取1mL納米微球溶液加入1mL去離子水再加入3mL、100 μ g/mL DSA于三頸瓶中，放入攪拌子，在磁攪拌下加熱到50°C反應(yīng)4h，