一種棘孢曲霉菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種棘孢曲霉菌株及其應(yīng)用，屬于發(fā)酵工程與生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC 3. 2. L 21)，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水 解酶，它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相 應(yīng)的配基，這種酶存在于許多植物體，還存在于一些酵母、霉菌、木霉菌屬及細(xì)菌甚至是昆 蟲體內(nèi)。β-葡萄糖苷酶可以將水果、蔬菜、茶葉中的風(fēng)味前體物質(zhì)β-糖苷水解為具有濃 郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)。
[0003] 葡萄糖苷酶的可運(yùn)用領(lǐng)域廣泛：可以用在果汁行業(yè)用于增香脫苦，很多果汁 中含有很多風(fēng)味前體物質(zhì)一一 β -糖苷，只要通過一些酶的作用就能使這些糖苷配基揮發(fā) 釋放，起到增香的作用，在眾多的研宄中發(fā)現(xiàn)，棘孢曲霉產(chǎn)的葡萄糖苷酶對(duì)蘋果汁、檸檬汁、 茶汁的增香效果良好；另外在果酒中的增香目前也是研宄的熱點(diǎn)，對(duì)于脫苦的原理和增香 類似，例如在青梅汁中，葡萄糖苷酶可以將其中的苦杏仁苷分解為苯甲醛及氫氰酸和兩分 子的葡萄糖，這就使青梅的苦味大大減少；葡萄糖苷酶的脫苦還可以用在柑橘、橄欖等具有 一定苦味的水果中。
[0004] 另外，還可以用于一些糖苷類前體的分解來生產(chǎn)分解后產(chǎn)物，例如低聚龍膽糖的 生產(chǎn)、大豆異黃酮的生產(chǎn)，這兩種產(chǎn)物的前體都是以結(jié)合型的糖苷形式存在。除了以上這些 領(lǐng)域，β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用領(lǐng)域還很寬泛，比如制造生物酒精，通過基因技術(shù)來達(dá)到防治 病蟲害的目的，以及一些天然染料的生產(chǎn)，動(dòng)物飼料的生產(chǎn)甚至是醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的棘孢曲霉菌株胞外β -葡萄糖苷酶活性不高，本 申請(qǐng)的發(fā)明人獲得一株具有較高胞外β-葡萄糖苷酶活性的棘孢曲霉菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一株具有較高胞外β -葡萄糖苷酶活性的棘孢曲霉菌株。
[0007] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供該棘孢曲霉菌株在產(chǎn)生葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是： 一種棘孢曲霉菌株，該棘孢曲霉菌株的保藏名稱為：曲霉（Aspergillus sp.)BG30,保 藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期：2013年06月28日，保藏編號(hào)：CGMCC No. 7799。
[0009] 本發(fā)明棘孢曲霉菌株的菌落形態(tài)特征：在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，25°C黑暗 條件下培養(yǎng)7天，菌落直徑60-65mm，質(zhì)地絨狀；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)大量形成，分生孢子頭紫褐色，初 期球形，后期開裂，菌落背面淺褐色。分生孢子梗大，寬8. 5-11. 0 μ m，褐色，壁光滑，頂囊球 形，直徑33-42 μ m，全部表面可有；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，瓶梗6-10* μ m，分生孢子橢圓形，少數(shù)球 形或近球形，淺到褐色，具明顯小刺，2. 9-4. 7*2. 5-4. 0 μ m，未見有性孢子。
[0010] 所述棘孢曲霉菌株應(yīng)用于β-葡萄糖苷酶中的生產(chǎn)，具體包括以下步驟： (1) 將曲霉（Asper價(jià)7Λλ5 5/7. ) BG30接入斜面培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得種子； (2) 將種子接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液進(jìn)行分離獲得β -葡萄糖苷酶粗酶 液，所述粗酶液經(jīng)過分離、純化獲得β-葡萄糖苷酶。
[0011] 培養(yǎng)條件影響棘孢曲霉菌株的繁殖，進(jìn)而影響其生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力，步 驟（1)中增殖培養(yǎng)的條件為溫度28~34°C，培養(yǎng)時(shí)間56~150h ;步驟（2)中發(fā)酵培養(yǎng)的條件 為溫度28~34°C，培養(yǎng)時(shí)間56~150h。
[0012] β -葡萄糖苷酶作為胞外產(chǎn)物，發(fā)酵完成后，β -葡萄糖苷酶存在于發(fā)酵液中，通 過常規(guī)的酶分離純化方法即可分離純化獲得高酶活的β-葡萄糖苷酶。
[0013] 培養(yǎng)基的種類也是影響棘孢曲霉菌株繁殖的重要條件，步驟（1)中斜面培養(yǎng)基的 組成為：葡萄糖2. 0-5. 0g，氯化鈉3. 0g，硝酸鉀3. 0g，磷酸氫二鉀0. 06g，硫酸銅0. 004g，麩 皮10. 0g，酒石酸鉀鈉0. 005g，氯化鐵0. 005g，硫酸錳0. 005g，瓊脂20. 0g，乳糖0-10. 0g，蒸 餾水lOOOmL，pH值5. 5~6. 0,所述斜面培養(yǎng)基配置好后于0. 08Mpa滅菌20min，劃線接入曲 霉BG30進(jìn)行培養(yǎng)。
[0014] 步驟（2)中產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成以IL培養(yǎng)基計(jì)為：麩皮34~36g，硫酸銨I. 8~2. 0g， MgSO4 · 7H20 0· 4~0· 5g，蛋白胨 1. 2~I. 5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 008~0· Olg，葡萄糖 0-20g，pH 5· 45~5· 55。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： (1)本發(fā)明的棘孢曲霉菌株發(fā)酵時(shí)胞外β-葡萄糖苷酶的酶活性高，副產(chǎn)物少，β-葡 萄糖苷酶易分離純化，分離純化成本低，因此，以本發(fā)明的棘孢曲霉菌株作為出發(fā)菌株發(fā)酵 生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0016] (2)本發(fā)明的棘孢曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，工業(yè)化生產(chǎn)中配料簡(jiǎn)單，無需預(yù)處 理，可以顯著降低生產(chǎn)成本。
[0017] (3)本發(fā)明的棘孢曲霉菌株的培養(yǎng)條件工藝參數(shù)設(shè)計(jì)合理，過程易于控制。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0019] 1、菌株的分離純化 1.1樣本采集：從小竹林排水溝、野生茶樹下、腐爛竹葉和枯桃樹木等下的土壤中采集 25個(gè)土壤樣品于無菌試管中。
[0020] 1. 2樣本處理 試劑準(zhǔn)備：含抗生素的樣本處理液配置：氨芐青霉素 lg，卡那霉素〇.55g，氯化鈉 8. 5g，吐溫Ig溶于適量水中；Ig氯霉素用4. 5ml乙醇溶解；將乙醇-氯霉素溶液混入第一 步所得溶液中，定容至IL得到處理液。
[0021] 篩選培養(yǎng)基：含甲基紅的察氏培養(yǎng)基（g/L):CMC_Na 15. 0,硝酸鈉3. 0g，七水硫酸 鎂0. 5g，氯化鉀0. 5g，七水硫酸亞鐵0. 01g，磷酸氫二鉀l.Og，甲基紅0. 2g，瓊脂15g， 水 I. 0L。
[0022] 樣品處理：在每支含土壤樣本的無菌試管中加入IOmL含抗生素的樣品處理液，并 于高速混勻機(jī)中混勻，靜置30min。
[0023] 接種：分別將混合后的處理液取50 μ L于2mL的離心管中（第一管)，并加入950 μ L 生理鹽水(無抗生素）即稀釋20倍，從第一管中取50uL于第二管并計(jì)入950 μ L生理鹽水， 以上步驟重復(fù)，最后取稀釋倍數(shù)為400,8000,160000的10 μ L涂布于平板，于28°C霉菌培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。
[0024] L 3平板初篩 試劑準(zhǔn)備：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮）200g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂15~20g/L，制得 IL培養(yǎng)基，分別倒試管斜面、平板。
[0025] 菌落挑?。喝我幻咕臃N于PDA斜面上于28°C霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0026] L 4試管搖床復(fù)篩 1. 4. 1試劑準(zhǔn)備：配制IOX的真菌、細(xì)菌復(fù)篩培養(yǎng)基濃縮液： 真菌培養(yǎng)基濃縮液?。∟H4)2SO4 20 g/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2 4g/L，MgSO4 ·7Η20 4g/L。 細(xì)菌培養(yǎng)基濃縮液：KH2PO4 100g/L，NaCl 20g/L，MgSO4WH2O 2g/L濃縮液配制完成后 于滅菌鍋滅菌，放于無菌柜，待用。
[0027] 1. 4. 2濃縮液配制培養(yǎng)基： 真菌：取濃縮液適量，加入纖維二糖0. 3g/L，CMC-Na 0. 5g/L，然后將體積定容到濃縮 液的10倍。
[0028] 細(xì)菌：取濃縮液適量，加入纖維二糖0.3 g/L，蛋白胨I g/L，將溶液定容到濃縮 液的10倍。
[0029] ρΗ4· 5 的 0· 2 mol/L Na2HPO4-O. I mo mol/L 的檸檬酸緩沖液的配制：0· I mol/L 的 梓檬酸用磷酸二氫鈉滴定至pH4. 5,定容。
[0030] 5 mmol /L的P-NPG (對(duì)硝基苯基葡萄糖苷）底物溶液 N