蜻蜓腸道菌土曲霉qt122及其代謝產(chǎn)物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，涉及蜻蜓腸道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株及其代謝產(chǎn)物和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 昆蟲是地球生物圈中已知種類最多的一群生物，與昆蟲共生的特境微生物具有豐 富的多樣性。據(jù)已有的研宄報(bào)道我們可以知道昆蟲共生菌不僅種類繁多，而且在生態(tài)、代謝 特征、生理活性等方面均有一定的特殊性，因此其可能是抗菌、除草劑等新型藥源分子的廣 泛來源。但與昆蟲種類相比，目前人們對(duì)昆蟲共生菌研宄較少，對(duì)其代謝產(chǎn)物研宄更少，因 此，研宄昆蟲共生菌及其次生代謝產(chǎn)物對(duì)開拓發(fā)現(xiàn)新型活性物質(zhì)具有重要意義。
[0003] 稗草（Echinochloa crusgalli)是世界性十大惡性雜草之一，是稻田、麥田地等最 重要的草害。近年來已經(jīng)上升為水稻產(chǎn)區(qū)第一惡性雜草，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量及品質(zhì)。反枝 莧（Amaranthus retroflexus)是入侵種中發(fā)生頻率最多、分布最廣、危害最嚴(yán)重的雜草， 是菜園、果園及棉花和玉米等旱作物地中的常見雜草，并且該植物可富集硝酸鹽，家畜過量 食用后會(huì)引起中毒，造成大量經(jīng)濟(jì)損失。目前治理稗草和反枝莧危害的主要措施是化學(xué)防 治。隨著化學(xué)除草劑的廣泛應(yīng)用，其弊端日趨突出，化學(xué)除草劑造成環(huán)境污染，農(nóng)藥殘留以 及雜草抗藥性的問題已經(jīng)引起農(nóng)藥科技工作者的高度關(guān)注，開發(fā)研制高效安全、無污染的 新型除草劑迫在眉睫。微生物源除草劑以其資源豐富、毒性小、不破壞生態(tài)環(huán)境、殘留少、選 擇性強(qiáng)、對(duì)非靶標(biāo)生物和哺乳動(dòng)物安全、環(huán)境兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，正逐步引起人們的重視，是 新型除草劑的重要研宄方向。已有研宄表明昆蟲腸道菌可能合成植物毒素，這類毒素能殺 死植物以利于昆蟲消化攝入的植物，如Zhang等分離篩選出具有除草活性的棉蝗腸道真菌 HC02(Phoma sp.)和負(fù)幢腸道真菌FHOl (Curvularia sp.)，并從其代謝產(chǎn)物中分離到同樣 具有較好除草活性的單體化合物。因此，昆蟲腸道共生菌可能是新型除草劑的重要來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種蜻蜓腸道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株及其及其代謝產(chǎn)物和用途。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供土曲霉QT122,為Aspergillus terreus QT122,其保藏編號(hào)為：CCTCC M 2015240。
[0006] 土曲霉QT122,保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC);保藏名稱為： Aspergillus terreus QT122 ;保藏地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏日期：2015年4月17日； 保藏號(hào)：CCTCC NO :M 2015240。
[0007] 本發(fā)明還同時(shí)提供了土曲霉QT122發(fā)酵液的制備方法，包括以下步驟：
[0008] 1)、活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)接入麥芽液體培養(yǎng)基中，于 27. 5~28. 5°C (較佳為28°C )、160~180rpm/min (較佳為170rpm/min)的條件下培養(yǎng)2~ 3d (較佳為3d)作為種子液；
[0009] 備注說明：活化為經(jīng)麥芽固體培養(yǎng)基的活化；即，具體為：從保藏菌種的MEA試管 斜面中取帶菌的菌絲體塊（約1~2g)于新鮮的麥芽固體培養(yǎng)基（MEA)上，然后于28°C恒 溫箱中倒置培養(yǎng)，得到活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)。
[0010] -般而言，將活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的菌絲體塊（約2~ 3g)接種到裝有150mL麥芽液體培養(yǎng)基（ME培養(yǎng)基）中于上述條件下進(jìn)行培養(yǎng)；就能得到 種子液；
[0011] 2)、將種子液按照1%~2%體積比的接種量接入麥芽液體培養(yǎng)基中，于27. 5~ 28. 5°C (較佳為28°C )、160~180rpm/min (較佳為170rpm/min)的條件下培養(yǎng)6~8d (較 佳為7d)，得土曲霉QT122發(fā)酵液。
[0012] 本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述土曲霉QT122發(fā)酵液制備土曲霉QT122代謝產(chǎn)物的 方法，包括以下步驟：
[0013] 1)、將土曲霉QT122發(fā)酵液利用紗布（例如為4層紗布）進(jìn)行過濾，得濾液（為對(duì) 反枝莧和稗草的幼根生長(zhǎng)具有抑制作用的發(fā)酵濾液）；
[0014] 將濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取后，真空減壓濃縮干燥（于0. 1個(gè)負(fù)壓的真空度，45°C干燥 30~40分鐘），得土曲霉QT122發(fā)酵液粗提物（為褐色）；
[0015] 2)、將土曲霉QT122發(fā)酵液粗提物用硅膠柱層析進(jìn)行粗分，采用二氯甲烷/甲醇進(jìn) 行梯度洗脫，所述二氯甲烷與甲醇的體積比依次為：1〇〇:〇, 100:1，100:2, 100:4, 100:8, 100 :16, 100:32 ;進(jìn)而相應(yīng)得到7個(gè)餾分：F1~F7 ;
[0016] 3)、將Fl和F2分別進(jìn)行如下操作：濃縮后用甲醇重結(jié)晶；總共得到4個(gè)土曲霉 QT122代謝產(chǎn)物。
[0017] 備注說明：Fl對(duì)應(yīng)得到的是化合物1和化合物2, F2對(duì)應(yīng)得到的是化合物3和化 合物4。
[0018] 本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述方法制備而得的4種土曲霉QT122代謝產(chǎn)物，分別 具有如下結(jié)構(gòu)式：
[0019]
r\
[0020] 本發(fā)明還同時(shí)提供了上述土曲霉QT122的用途：用于抑制反枝莧或稗草幼根的生 長(zhǎng)。
[0021] 作為本發(fā)明的土曲霉QT122的用途的改進(jìn)：土曲霉QT122發(fā)酵液、土曲霉QT122發(fā) 酵液粗提物、土曲霉QT122代謝產(chǎn)物均能用于抑制反枝莧或稗草幼根的生長(zhǎng)。
[0022] 本發(fā)明還同時(shí)提供了一類對(duì)反枝莧和稗草的幼根生長(zhǎng)具有抑制活性的生物農(nóng)藥， 該生物農(nóng)藥中含有以下任意一種：土曲霉QT122發(fā)酵液、土曲霉QT122發(fā)酵液粗提物、土曲 霉QT122代謝產(chǎn)物。
[0023] 麥芽固體培養(yǎng)基（MEA培養(yǎng)基）為：生麥芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，瓊脂20g，蒸 餾水1L。
[0024] 麥芽液體培養(yǎng)基（ME培養(yǎng)基）為：生麥芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，蒸餾水1L。
[0025] 在本發(fā)明中，土曲霉QT122代謝產(chǎn)物的用法和用量可參照2, 4-D的用法和用量。
[0026] 即，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種蜻蜓腸道共生土曲霉（Aspergi I Ius terreus QT122)菌株及其用途；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述的蜻蜓腸道共生土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的培養(yǎng)物；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述培養(yǎng)物的 制備方法；本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述培養(yǎng)物的用途；本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供具 有抑制反枝莧、稗草等雜草的幼根生長(zhǎng)作用的微生物源農(nóng)藥。
[0027] 綜上所述，本發(fā)明的蜻蜓腸道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株，該 菌發(fā)酵液及其代謝產(chǎn)物具有抑制反枝莧和稗草幼根生長(zhǎng)的活性，因此對(duì)開發(fā)新型微生物源 除草劑具有重要的價(jià)值。本發(fā)明提供的菌株具有較好的除草活性可應(yīng)用于制備微生物源除 草劑。
【附圖說明】
[0028] 圖1為蜻蜓腸道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株的培養(yǎng)特征圖；
[0029] 圖2蜻蜓腸道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)菌株的孢子形態(tài)特征 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋。
[0031] 實(shí)施例1、蜻蜓腸道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的分離、純化與鑒 定：
[0032] 供試蜻蜓采自浙江師范大學(xué)附近郊區(qū)。將捕捉回來的蜻蜓饑餓處理24h，于無菌條 件下用75% (體積％ )酒精進(jìn)行表面消毒2min，再用無菌水漂洗3次后用無菌鑷子解剖。 取出腸道置于無菌研缽中，加少量無菌水進(jìn)行研磨，再用無菌水將其稀釋成1〇'1〇_ 2、1〇_3 三個(gè)濃度梯度。分別取各濃度梯度稀釋液〇.2mL涂布于麥芽固體培養(yǎng)基（MEA培養(yǎng)基）上， 于28°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，從菌落邊緣挑取少量菌絲，轉(zhuǎn)接到新的MEA培養(yǎng) 基上，如此反復(fù)轉(zhuǎn)接得到單菌落，并將該單菌落QT122保存至MEA試管斜面?zhèn)溆谩?br>[0033] 按照BioTeke新型快速基因組DNA提取試劑盒說明書，提取上述所得的共生 菌 QT122 基因組 DNA，采用 ITS 通用引物 ITSl (5, -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 正向）和 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向）擴(kuò)增 rDNA ITS 區(qū)基因序列并純化。
[0034] 測(cè)序結(jié)果通過BLAST程序進(jìn)行相似度比較；分析結(jié)果表明，共生真菌QT122與 Aspergillus terreus (KM 924436)具有較高相似度，相似度為99%。結(jié)合該菌形態(tài)學(xué)特征， 鑒定該菌為A. terreus。
[0035] 上述MEA培養(yǎng)基配方為：生麥芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，瓊脂20g，蒸餾水lL，pH 7.0, 并于I. 1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌20min (為常規(guī)滅菌）。
[0036] 將上述土曲霉（Aspergillus terreus)轉(zhuǎn)接至MEA試管斜面保存?zhèn)溆谩?br>[0037] 對(duì)上述土曲霉（Aspergillus terreus)進(jìn)行了菌種保藏，保藏單位：中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心（CCTCC);保藏名稱為：Aspergi Ilus terreus QT122 ;保藏地址：中國(guó)武漢武 漢大學(xué)；保藏日期：2015年4月17日；保藏號(hào)：CCTCC NO :M 2015240。
[0038] 實(shí)施例2、蜻蜓腸道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的液體發(fā)酵：
[0039] 土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的活化：從保藏菌種的MEA試管斜面中取 帶菌的菌絲體塊（約1~2g)于新鮮的麥芽固體培養(yǎng)基（MEA)上，于28°C恒溫箱中倒置培 養(yǎng)，得到活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)。
[0040] 將活化好的土曲霉（Aspergillus terreus QT122)的菌絲體塊（約2~3g)接種 到裝有150mL麥芽液體培養(yǎng)基（ME培養(yǎng)基）的250mL三角瓶中，于28°C，170rpm/min的條 件下培養(yǎng)3d作為種子液；共接種6~7瓶。
[0041] 然后按照1 %體積比的接種量，將5ml的種子液轉(zhuǎn)接入裝有500mL麥芽液體培養(yǎng)基 (ME培養(yǎng)基）的1000 mL三角瓶中，于28°C，170rpm/min的條件下培養(yǎng)7d ;得土曲霉QT122 發(fā)酵液（簡(jiǎn)稱發(fā)酵液）。
[0042] 麥芽液體培養(yǎng)基（ME培養(yǎng)基）為：生麥芽20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，蒸餾水1L，pH 7.0, 并于I. 1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌20min (為常規(guī)滅菌）。
[0043] 實(shí)施例3、蜻蜓腸道共生土曲霉（Aspergillus terreus QT122)代謝產(chǎn)物的分離純 化：
[0044] 將按照實(shí)施例2所述方法制備而得的40L發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過濾，所得濾液用等 體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，共萃取3次，將萃取液經(jīng)真空濃縮干燥（于0. 1個(gè)負(fù)壓的真空 度，45°C干燥30~40分鐘），得到褐色的發(fā)酵液粗提物（26. 23g)。
[0045] 將所得的發(fā)酵液粗提物（26. 23g)用硅膠柱層析（200~300目的硅膠，約260g)進(jìn) 行粗分，采用二氯甲烷/甲醇進(jìn)行梯度洗脫，所述二氯甲烷與甲醇的體積比依次為：1〇〇:〇， 100:1，100:2, 100:4, 100:8, 100:16, 100:32 ;每種洗脫液的用量分別約為 5100ml、4500ml、 3750ml、3000ml、2250ml、1500ml、1500ml，流速為lOml/min。不同的梯度洗脫所得分別進(jìn)行 收集。
[0046] 將所得的第1種洗脫部分Fl進(jìn)行濃縮（于0. 1個(gè)負(fù)壓的真空度，45°C干燥30~ 40分鐘）后于甲醇中進(jìn)行重結(jié)晶，能分別得到化合物1(橙色針狀結(jié)晶，約5. Ig)和化合物 2 (橙色粉末，約6. 9g)。對(duì)所得的第2種洗脫部分F2進(jìn)行同樣的處理（即，濃縮后于甲醇中 進(jìn)行重結(jié)晶），得到化合物3 (白色針狀結(jié)晶，約12. Ig)和化合物4 (黃色粉末，約15. 9g)。 共得到上述4個(gè)單一代謝產(chǎn)物。最后結(jié)合多種波譜技術(shù)對(duì)所述4個(gè)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
[0047] 上述4個(gè)化合物的波譜數(shù)據(jù)為：
[0048] 化合物 1 :橙色針狀結(jié)晶。ESI-MS:m/