長(zhǎng)孢婁徳酵母及其富硒培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種長(zhǎng)孢婁徳酵母及其富硒培養(yǎng)方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 硒是水產(chǎn)動(dòng)物的必需微量元素之一，具有抗氧化，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，調(diào)節(jié)機(jī)體代 謝，增強(qiáng)繁殖能力，降低某些重金屬中毒等功能。硒缺乏會(huì)造成魚(yú)的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px)活性降低，機(jī)體抗氧化能力減弱，致使機(jī)體自由基堆積，防病抗病能力下降。硒能 顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的抵抗力，并且有機(jī)硒的效果要優(yōu)于無(wú)機(jī)硒。
[0003] 酵母因?yàn)槠渖L(zhǎng)速度快，培養(yǎng)方便，含有高達(dá)50 %以上的蛋白質(zhì)，更富含豐富的B 族維生素（尤其是B1，B2)和眾多對(duì)人體有益的礦物質(zhì)，而成為了應(yīng)用最廣泛最安全的營(yíng)養(yǎng) 微生物。對(duì)于一些微量營(yíng)養(yǎng)元素，酵母還具有很強(qiáng)的富集作用，更能將有毒無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為被 無(wú)毒易吸收的有機(jī)硒，與其他的一些無(wú)機(jī)硒相比，富硒酵母存在以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：1.利用率 高；2.毒性低；3.營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高；4.硒含量高；5.生理活性高。因此利用酵母來(lái)富集硒是一 個(gè)安全又高效的辦法，所以富硒酵母漸漸成為了目前科研中的研宄熱點(diǎn)之一，目前實(shí)驗(yàn)室 應(yīng)用較多的有：假絲酵母、裂殖酵母和一些釀酒酵母。而針對(duì)宿主動(dòng)物篩選的內(nèi)源益生菌可 以更好地競(jìng)爭(zhēng)宿主腸道中的黏附位點(diǎn)，成為優(yōu)勢(shì)菌群并在停止攝入后具有持續(xù)定植功能。
[0004] 作為富硒酵母，富硒效率是評(píng)價(jià)其富硒性能的基本指標(biāo)，包括酵母的生物量及有 機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率，而從原料利用與轉(zhuǎn)化上來(lái)看，富硒條件是直接影響酵母富硒效率的重要因 素，因此確定富硒的最優(yōu)發(fā)酵條件，可以有效地提高酵母的生物量及有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率，綜合 提高富硒效率，對(duì)富硒酵母的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及生產(chǎn)應(yīng)用具有實(shí)際指導(dǎo)意義。
[0005] 目前國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的富硒酵母有釀酒酵母、漢遜酵母、假絲酵母等，細(xì)胞含硒量在 650~2050 μ g/g之間。未見(jiàn)有關(guān)長(zhǎng)孢婁徳酵母作為富硒酵母的相關(guān)研宄的公開(kāi)報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種新的富硒長(zhǎng)孢婁徳酵母。
[0007] 解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下。
[0008] 一種長(zhǎng)抱婁徳酵母（Lodderomyces elongisporus)，其保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M 2015301。
[0009] 本發(fā)明需要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是提供上述長(zhǎng)孢婁徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的富硒培養(yǎng)方法。
[0010] 解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下。
[0011] 長(zhǎng)孢婁徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的富硒培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0012] 將長(zhǎng)抱婁徳酵母（Lodderomyces elongisporus)接種于所述YEF1D培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，體積比百分比5% -10%的接種量；于對(duì)數(shù)期6h，9h，12h時(shí)分3次加硒，添加量分別為 20-30 %，20-30 %，40-60 %，使硒在 YEPD 培養(yǎng)基中終濃度為 10-20 μ g/mL，28-37 °C 振蕩培 養(yǎng)24h_48h，得到富硒的長(zhǎng)抱婁徳酵母（Lodderomyces elongisporus)。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，接種量為10 %，培養(yǎng)時(shí)間為36h。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，于對(duì)數(shù)期6h，9h，12h時(shí)分3次梯度加硒，添加量分別為 25 %，25 %，50 %，使硒在YEH)培養(yǎng)基中終濃度為20 μ g/mL。
[0015] 本發(fā)明需要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是提供上述長(zhǎng)孢婁徳酵母（Lodderomyces elongisporus)的應(yīng)用。
[0016] 解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下。
[0017] 上述保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2015301的長(zhǎng)孢婁徳酵母（Lodderomyces elongisporus)或者富硒的長(zhǎng)孢婁徳酵母（Lodderomyces elongisporus)在制備水產(chǎn)動(dòng)物 有機(jī)硒飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0018] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述水產(chǎn)動(dòng)物為日本鰻麵。
[0019] 一種水產(chǎn)動(dòng)物有機(jī)硒飼料添加劑，其活性物質(zhì)含有上述長(zhǎng)孢婁徳酵母 (Lodderomyces elongisporus)〇
[0020] 本發(fā)明所述的長(zhǎng)抱類(lèi)徳酵母（Lodderomyces elongisporus)已于2015年5月15 日保藏于國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type CultureCollection,簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，地址：武漢市武昌珞珈山，武漢大學(xué)），保藏日期 2015 年 5 月 15 日，保藏編號(hào) CCTCC NO :M 2015301。
[0021] 本發(fā)明提供了一種新的長(zhǎng)孢婁徳酵母，富硒效率高，富硒性能良好，具有生產(chǎn)有機(jī) 硒的可行性，可作為富硒酵母菌株，在有機(jī)硒動(dòng)物飼料添加劑的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中具有良好應(yīng)用 前景。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1加硒方式對(duì)SCLE01富集硒的影響的結(jié)果示意圖；
[0023] 圖2為接種量對(duì)SCLE01富集硒的影響的結(jié)果示意圖；
[0024] 圖3為培養(yǎng)時(shí)間對(duì)SCLE01富集硒的影響結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式 不限于此。
[0026] 應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例 中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室 手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制 造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 實(shí)材料與方法
[0029] I. 1試驗(yàn)材料
[0030] I. I. 1 菌種
[0031] 本發(fā)明由發(fā)明人利用選擇性培養(yǎng)基篩選分離自淡水魚(yú)類(lèi)腸道的長(zhǎng)孢婁徳酵母，對(duì) 其進(jìn)行ITS序列和hsp78基因分析，鑒定結(jié)果表明該菌屬于長(zhǎng)孢婁德酵母，是一株新的長(zhǎng)孢 婁德酵母，其分類(lèi)命名為L(zhǎng)odderomyces elongisporus，編號(hào)為SCLE01，并已于2015年5月 15日保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC NO :M 2015301。
[0032] 本發(fā)明所述的長(zhǎng)孢洛德酵母SCLEOl (L. elongisporus SCLE01，保藏號(hào)為CCTCC NO :M 2015301)菌株的形態(tài)學(xué)特征為：菌落呈乳白色，略粗糙，固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，菌 落小0. 5-lmm，表面比較光滑，邊緣整齊，菌落隆起，致密度較高；在液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng) 后，培養(yǎng)液澄清且有沉淀，并有菌蹼出現(xiàn)；顯微鏡觀察顯示菌體呈橢圓形。
[0033] 以下保藏號(hào)為CCTCC NO :M 2015301的長(zhǎng)孢婁徳酵母簡(jiǎn)稱(chēng)為SCLE01。
[0034] I. 1. 2 培養(yǎng)基
[0035] YEro :酵母粉（YE)1%，蛋白胨（P)2%，葡萄糖（D)2%。固體培養(yǎng)基添加1. 5% 的瓊脂粉。
[0036] 麥芽汁培養(yǎng)基（ME):購(gòu)自環(huán)凱微生物有限公司，固體培養(yǎng)基添加1. 5%的瓊脂粉。
[0037] I. 1. 3試劑與設(shè)備
[0038] 亞硒酸鈉、變色酸、鹽酸苯肼、高氯酸、氯化鉀、鹽酸、EDTA_2Na均為分析純。
[0039] 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精科，UV 759)，潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰，SW-CJ)，臺(tái) 式高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma，3-18K)，恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣，DHG-9070A)，調(diào)溫電熱板 (常州澳華，DB-3C)，振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)，HZQ-F160)。
[0040] 1. 2試驗(yàn)方法
[0041] 1.2.1菌種活化
[0042] SCLE01菌株保種菌液2%接種量接種于YEH)液體培養(yǎng)基中，30°C，190rpm，24h，活 化3次后備用。
[0043] 1. 2. 2菌株鑒定
[0044] 將SCLE01菌株純化后富集，用生理鹽水洗去培養(yǎng)基，加入小鋼珠，用新芝高通量 組織研磨機(jī)進(jìn)行研磨破碎后利用天根細(xì)菌基因組試劑盒進(jìn)行DNA提取，將提取的DNA進(jìn)行 ITS序列及hsp78序列擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送往生工生物 工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用NCBI-BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)中進(jìn)行同 源性檢索。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。
[0045] ITS PCR擴(kuò)增引物序列如下：
[0046] ITSl :5' 一TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（SEQ ID NO. 1)
[0047] ITS4 :5' 一TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'（SEQ ID NO. 2)
[0048] Hsp78PCR擴(kuò)增引物序列如下：
[0049] LEhsp78-F :5' 一TTGCTCCTCCAAGTGCT- 3,（SEQ ID NO. 3)
[0050] LEhsp78-R :5' 一CAACCCAAACATCTCCC-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0051] 長(zhǎng)孢婁德酵母SCLE01經(jīng)ITSl和ITS4引物擴(kuò)增、測(cè)序、鑒定后獲得了 495bp的擴(kuò) 增產(chǎn)物，序列結(jié)果為