普羅威登斯菌(Providencia sp.)2D在鄰苯二甲酸二丁酯污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及普羅威登斯菌 sp. )2D在鄰苯二甲酸二丁醋污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸二丁醋（di-/?-butylphthalate，DBP)屬于鄰苯二甲酸醋類化合物 (Phthalic acidester，PAEs)，是塑料工業(yè)最主要的增塑劑之一，也是農(nóng)藥、染料去污劑的 載體以及諸多化妝品、紡織品的生產(chǎn)原料，廣泛用于食品包裝材料、容器、醫(yī)療器械以及兒 童玩具等領(lǐng)域。由于上述制品的大量應(yīng)用，DBP已經(jīng)成為全球性的有機(jī)污染物，廣泛存在于 大氣、水體、土壤以及生物體中。特別是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于塑料薄膜和塑料大棚的廣泛應(yīng) 用，殘留在農(nóng)業(yè)土壤中DBP極易通過食物鏈在人體中富集。DBP及其代謝物能夠?qū)C(jī)體造 成生殖毒性、發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、多器官癌變等多種損傷，因此美國環(huán)保署（EPA)和中國國 家環(huán)境監(jiān)測中心（CNEMC)都已將它列為優(yōu)先控制污染物。
[0003] 研宄表明，DBP的水解和光解速率都非常緩慢，生物降解是其在環(huán)境中分解的主要 途徑。因此，獲得DBP高效降解菌是提高其生物降解效率的重要環(huán)節(jié)。利用微生物降解作 用，將DBP轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)或完全礦化，是公認(rèn)的去除環(huán)境中DBP污染的最佳手段。由于環(huán) 境中DBP的普遍存在，DBP降解菌的出現(xiàn)頻率也很高，目前對DBP有降解作用的微生物大多 數(shù)為戈登氏菌屬、農(nóng)桿菌屬、不動桿菌屬和赤紅球菌屬等，但已報道的這些細(xì)菌對于DBP的 生物降解不完全，會產(chǎn)生毒性更高的中間代謝產(chǎn)物，或者其降解速率還不能滿足實際污染 控制的要求，因此仍需篩選更加高效的專性或兼性降解菌。
[0004] 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，土壤的DBP污染已經(jīng)得到人們廣泛關(guān)注。DBP污染土壤的微 生物修復(fù)技術(shù)中需要解決的首要問題是高效降解菌株的篩選與構(gòu)建。普羅威登斯菌屬 是堆肥中廣泛存在的一類細(xì)菌，目前尚無關(guān)于其降解PAEs的報道。另外，堆 肥在改善土壤結(jié)構(gòu)和保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境方面具有高效、環(huán)保和低成本等優(yōu)勢，結(jié)合篩選獲 得的高效降解菌，對降低農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境中DBP污染具有十分廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供普羅威登斯菌sp. 2D在 鄰苯二甲酸二丁酯污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的： 普羅威登斯菌（/7TOhofez7Cia sp. ) 2D在DBP污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用，所述普羅威登斯 菌sp. 2D于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保 藏編號為CCTCC M 2015057,保藏地址為：湖北省武漢市武漢大學(xué)。
[0007] DBP污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)中需要解決的首要問題是高效降解菌株的篩選與 構(gòu)建。普羅威登斯菌屬是堆肥中廣泛存在的一類細(xì)菌，目前尚無關(guān)于其降 解PAEs的報道。本發(fā)明從動物糞堆肥中分離篩選獲得一株對DBP具有高效、完全降解性能 的普羅威登斯菌，命名為sp. 2D，并發(fā)現(xiàn)該菌可有效降低土壤中的DBP污染， 是理想的土壤環(huán)境污染修復(fù)微生物。
[0008] 所述菌株/7Toriofeflcia sp. 2D通過富集培養(yǎng)法從農(nóng)場動物奠堆肥樣品中富集獲 得，該菌的最適生長條件為：溫度30~40°C，pH為7. 0~8. 5。
[0009] 所述菌株sp. 2D在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB)上(酵母粉5. 0 g， 蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，pH= 7.0)劃線培養(yǎng)7天，菌落呈橘黃色，質(zhì)地膏狀，豐厚濕 潤，易被挑起，邊緣較?。粧呙桦娮语@微鏡下呈長桿狀，長約1. 5~3. 0 μm，寬約0. 5~ 〇. 8 μπι ;經(jīng)革蘭氏染色鑒定該菌為革蘭氏陰性菌。
[0010] 所述菌株/7Toriofeflcia sp. 2D的生理生化鑒定實驗結(jié)果如下：甲基紅試驗（陽 性)、V-P試驗（陰性)、吲哚反應(yīng)（陽性)、檸檬酸鹽利用（陽性)、肌醇產(chǎn)酸試驗（陽性)、葡萄糖 產(chǎn)酸試驗（陽性)、淀粉水解試驗（陰性)、尿酶試驗（陽性)、明膠液化試驗（陰性)、硝酸鹽還原 (陽性)、氧化酶試驗（陰性）和葡萄糖產(chǎn)氣試驗（陰性)。
[0011] 所述菌株sp. 2D的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO :1所示，通過 NCBI官方網(wǎng)站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的BLAST程序與其他已登錄細(xì)菌菌株16S rDNA序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明該菌株與sp.相似性最高，同源率達(dá)99%。
[0012] 優(yōu)選地，上述應(yīng)用為：在DBP污染的土壤中接種普羅威登斯菌Providencia sp. 2D，所述普羅威登斯菌Providencia sp. 2D的用量為：每200g含100mg/kg DBP的污染 土壤中添加普羅威登斯菌Providencia sp. 2D菌懸液（OD6tltlmi= 0. 8) 50mL。
[0013] 上述普羅威登斯菌sp. 2D降解鄰苯二甲酸二丁醋的應(yīng)用具體為： 將普羅威登斯菌sp. 2D活化后制得的菌懸液接入受鄰苯二甲酸二丁酯污染 的土壤中。
[0014] 作為一種更優(yōu)選的技術(shù)方案，上述應(yīng)用是將普羅威登斯菌sp. 2D經(jīng) 過過夜活化、震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，收集菌體，根據(jù)實際需要調(diào)節(jié)菌體含量并制成菌懸液，將 制得的菌懸液接入受鄰苯二甲酸二丁酯污染的土壤中。
[0015] 另外，發(fā)明人研宄還發(fā)現(xiàn)在DBP污染土壤中同時添加動物糞堆肥可進(jìn)一步增強(qiáng)土 壤中DBP的降解，因此，本發(fā)明所述具體應(yīng)用的過程中，還可以在DBP污染的土壤中添加動 物奠堆肥混勾后再接入普羅威登斯菌sp. 2D ;所述動物奠堆肥與DBP污染土 壤的質(zhì)量比為1 :15。
[0016] 本發(fā)明還提供普羅威登斯菌sp. 2D在制備DBP污染土壤修復(fù)改良 劑中的應(yīng)用。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了普羅威登斯菌/7Toriofeflcia sp. 2D在DBP污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用，具體 是在DBP污染的土壤中接種普羅威登斯菌sp. 2D ;接2D菌的土壤在第10天 DBP殘留量為34. 46 mg/kg，降解率達(dá)到了 65%，而未接菌的對照土壤DBP降解率僅為19%， 相比對照提高了 46% ;另外，在添加了堆肥并接菌的土壤中，其第十天的DBP降解率達(dá)到了 88%，表明堆肥可增強(qiáng)土壤中DBP的降解，將ofeflciasp. 2D菌與堆肥結(jié)合使用，可高效 修復(fù)DBP污染的土壤，對降低農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境中DBP污染具有十分廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1為Providencia sp. 2D在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的生長形態(tài)。
[0019] 圖2為sp. 2D的掃描電鏡圖。
[0020] 圖 3 為 sp. 2D 的 16SrDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0021] 圖4為sp. 2D對DBP和鄰苯二甲酸的降解動力學(xué)曲線。
[0022] 圖5為/7TOFiofeflcia sp. 2D對不同土壤處理中DBP的降解效果。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的常規(guī)手段。
[0024] 實施例1鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的分離與鑒定 1、培養(yǎng)基配方 無機(jī)鹽培養(yǎng)液（MSM，g/L):K2HP04:5· 8 ;ΚΗ2Ρ04:4· 5 ; (NH4)2SO4:2. 0 ;MgCl 2:0· I6 ;CaCl 2: 0· 02 ;Na2Mo04 · 2H20 :0· 0024 ;FeCl3:0. 0018 ;MnCl 2 · 2H20 :0· 0015 ;調(diào)節(jié)無機(jī)鹽培養(yǎng)液的最 終pH為7. 5。添加 DBP，使其在無機(jī)鹽培養(yǎng)液中的濃度為50 mg/L，DBP作為唯一碳源。
[0025] 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB):酵母粉5. 0 g，蛋白胨10. 0 g，氯化鈉10. 0 g，加超純 水至1L，調(diào)節(jié)pH= 7. 0。121°C滅菌20分鐘。固體平板則添加 I. 5% (W/V)瓊脂粉。
[0026] 2、分離與鑒定 分離方法采用樣品懸液搖瓶法：稱取5 g堆肥樣品（取自農(nóng)場動物堆肥）于含有50 mL 無菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm條件下培養(yǎng)3天后取5 mL堆肥懸液加入100 mL含DBP (50 mg/L)的上述MSM培養(yǎng)基中。經(jīng)30°C，140 rpm下培養(yǎng)7天后，每次按取1 mL的接種量連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接10次，并相應(yīng)提高M(jìn)SM培養(yǎng)基中DBP含量至1000 mg/L (第二 次轉(zhuǎn)接，MSM培養(yǎng)基中DBP的含量為100mg/L，之后每轉(zhuǎn)接一次，MS