一種轉(zhuǎn)谷酰胺酶交聯(lián)大豆分離蛋白保護(hù)乳桿菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用轉(zhuǎn)谷酰氨酶交聯(lián)技術(shù)所形成的大豆分離蛋白凝膠對(duì)乳桿菌 進(jìn)行保護(hù)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳桿菌是在發(fā)酵食品和益生菌制品生產(chǎn)中經(jīng)常使用的菌株，也是哺乳動(dòng)物腸道內(nèi) 的有益微生物，主要的益生作用包括：平衡腸道菌群、改善腸道功能、控制血清膽固醇水平、 防止腹瀉、抗癌等。
[0003] 但在乳桿菌的應(yīng)用和食用過程中會(huì)遭遇各種脅迫，例如酸奶體系中的酸脅迫，腌 制品中的鹽脅迫，儲(chǔ)藏過程中的冷脅迫，益生菌進(jìn)入胃腸道將會(huì)遭受到膽鹽、酸、消化酶的 影響等，這些脅迫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致乳桿菌活菌數(shù)下降，進(jìn)而影響乳桿菌的發(fā)酵和益生性能。為了 確保益生菌在人體充分發(fā)揮益生作用，幾個(gè)國際組織已經(jīng)頒布了某些益生菌最小活菌數(shù)的 標(biāo)準(zhǔn)，他們要求在出售的發(fā)酵乳中，嗜酸乳桿菌最小活菌數(shù)應(yīng)達(dá)到10 7cfU/mL，雙歧桿菌應(yīng) 達(dá)到106cfu/mL。在日本，發(fā)酵乳和乳飲料協(xié)會(huì)要求在發(fā)酵乳飲品中雙歧桿菌活菌數(shù)至少要 達(dá)到 107cfu/mL。
[0004] 微膠囊（microencapsule)是一種能包埋和保護(hù)某些敏感性物質(zhì)的具有聚合物壁 殼的半透性的微型"容器"或"包裝物"。通過特殊的方法，利用天然或合成的高分子材料包 覆固體、液體甚至是氣體物質(zhì)，制成有囊壁的微型膠囊以及保留或截留其它物質(zhì)的微粒，從 而達(dá)到保護(hù)、控釋等效果，這一過程稱為微膠囊化（microencapsulation)。微膠囊化的目的 是建立一個(gè)微環(huán)境，在這里敏感的活性物質(zhì)可以在加工和貯存過程中更好的存活下來，然 后在消化道中適當(dāng)位點(diǎn)（例如小腸）被釋放出來。有研宄發(fā)現(xiàn)，在加工、貯存過程中，或者當(dāng) 乳桿菌在人體胃腸道中傳遞時(shí)，微膠囊能夠起到保護(hù)乳桿菌的作用。因?yàn)槲⒛z囊能削弱低 PH胃酸、膽鹽等脅迫環(huán)境對(duì)益生菌的傷害，同樣在液態(tài)產(chǎn)品，如乳制品中也有同樣的作用。
[0005] 通常，在以海藻酸等多糖凝膠為微膠囊化的壁材時(shí)，常會(huì)用到CaC12、甲醛、戊二醛 這樣的化學(xué)交聯(lián)劑或醛類固化劑，殘留的化學(xué)交聯(lián)大分子會(huì)存在毒性，嚴(yán)重限制了微膠囊 產(chǎn)品在食品中的應(yīng)用。而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為一種無毒的酶類可以催化多種蛋白形成水不 溶性的凝膠，替代常用的多糖凝膠，避免引入有毒的交聯(lián)劑，擴(kuò)大微膠囊在食品領(lǐng)域中的應(yīng) 用。將乳桿菌微膠囊制備成粉末狀可以使食品中的乳桿菌在加工、運(yùn)輸、貯存和食用之前保 持較高存活率。常用的干燥方法有噴霧干燥法和真空冷凍干燥法，因?yàn)槿闂U菌對(duì)溫度比較 敏感，所以通過真空冷凍干燥法制備微膠囊粉末，更有利于保持較高的存活率。因此利用轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶交聯(lián)大豆分離蛋白，并利用真空冷凍干燥技術(shù)制備乳桿菌微膠囊，勢必推動(dòng)微 膠囊領(lǐng)域的變革，為益生菌微膠囊的開發(fā)與應(yīng)用提供一個(gè)新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)谷酰胺酶交聯(lián)大豆分離蛋白保護(hù)乳桿菌的方法，通過 研宄微膠囊中乳桿菌的凍干存活率，確定達(dá)到最好保護(hù)作用的轉(zhuǎn)谷酰胺酶交聯(lián)大豆分離蛋 白的條件；對(duì)結(jié)構(gòu)特性的研宄，揭示交聯(lián)處理會(huì)加強(qiáng)保護(hù)性的原因；通過在模擬胃液和模 擬腸液中存活率的分析，確定微膠囊化后抗性提高；通過貯存穩(wěn)定性和在酸奶中的應(yīng)用實(shí) 驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其在發(fā)酵食品中應(yīng)用的可行性。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 一種轉(zhuǎn)谷酰胺酶交聯(lián)大豆分離蛋白保護(hù)乳桿菌的方法，包括以下步驟：
[0009] 一、采用滅菌蒸餾水配制4~10% (w/w)的大豆分離蛋白溶液，以0. 3~2mol/L HCl (HC1使用0· 22 μ m濾膜過濾除菌）調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液pH為6. 5~8. 0 ;
[0010] 二、按照10~40U/g蛋白質(zhì)的濃度加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase)，使用磁力攪拌器攪 拌均勻，在30~50°C交聯(lián)1~4h，然后立即使用冰水浴冷卻，之后放入2~8°C冰箱貯存?zhèn)?用。
[0011] 三、向經(jīng)交聯(lián)處理的大豆分離蛋白溶液中加入5~15倍乳桿菌濃縮液，其加入量 為經(jīng)交聯(lián)處理的大豆分離蛋白溶液的5~15% (w/w)，攪拌5~15min混合均勾后，再經(jīng)冷 凍干燥制備微膠囊，得到微膠囊化效率為67. 4±2. 7%。
[0012] 本發(fā)明中，所述的冷凍干燥是將乳桿菌與交聯(lián)處理后獲得的蛋白質(zhì)溶液混合均勻 后先在-15~-25°c預(yù)凍7~12h，然后真空冷凍干燥8~17h。
[0013] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0014] 1、本發(fā)明利用轉(zhuǎn)谷酰胺酶交聯(lián)大豆分離蛋白形成的凝膠對(duì)乳桿菌進(jìn)行保護(hù)。
[0015] 2、本發(fā)明拓展了凝膠制品的應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是在生物活性物質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0016] 3、本發(fā)明所獲得的利用轉(zhuǎn)谷酰胺酶交聯(lián)大豆分離蛋白包埋乳桿菌制備的鼠李糖 乳桿菌微膠囊在PH2. 5和pH3. 5的模擬胃液中作用2h后的存活率分別為5. 25±0. 50% 和12. 38±0. 62%，顯著高于未經(jīng)TGase交聯(lián)的對(duì)照組（P < 0. 01)(分別為1.04±0. 07% 和2. 87±0. 38% )。鼠李糖乳桿菌微膠囊在含有0. 3%和2%膽鹽的模擬腸液中作用4h 后的存活率分別為13. 82±0. 72%和4. 43±0. 50%，顯著高于未經(jīng)TGase交聯(lián)的對(duì)照組（P < 0· 01)(分別為 4. 21±0· 53%和 0· 92±0· 06% )。
[0017] 4、本發(fā)明含有乳桿菌的微膠囊具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，適用于在發(fā)酵食品等中 的應(yīng)用。鼠李糖乳桿菌微膠囊經(jīng)真空包裝后在4°C條件下貯藏21d后，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌 活菌數(shù)下降1.00Logl0(cfu/g)，存活率為10. 04±0. 50%。37°C條件下貯藏21d后，LGG 活菌數(shù)下降1.8禮呢10((^11/^)，存活率為1.30±0.04%。顯著高于未經(jīng)了6&%交聯(lián)的對(duì) 照組（P < 0.05)(存活率分別為：1.42±0. 12%和0. 17±0.01% )。將鼠李糖乳桿菌微 膠囊應(yīng)用于酸奶，在4°C下儲(chǔ)存21d后，鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)僅下降0. 73LoglO (cfu/g)， 存活率為14. 49±0. 53 %，極顯著高于未經(jīng)TGase交聯(lián)的對(duì)照組（P < 0. 01)(存活率為 2. 65±0· 46% )。
[0018] 5、本發(fā)明進(jìn)一步推廣了大豆分離蛋白凝膠和乳桿菌的實(shí)際應(yīng)用，進(jìn)而可以更好的 保護(hù)活乳桿菌的數(shù)量，為微膠囊化乳桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 圖1為不同TGase添加量制備的微膠囊的微膠囊化效率和未經(jīng)交聯(lián)凍干粉末中 LGG存活率；
[0020] 圖2為不同交聯(lián)時(shí)間制備的微膠囊的微膠囊化效率和未經(jīng)交聯(lián)凍干粉末中LGG存 活率；
[0021] 圖3為不同交聯(lián)溫度制備的微膠囊的微膠囊化效率和未經(jīng)交聯(lián)凍干粉末中LGG存 活率；
[0022] 圖4為不同交聯(lián)pH制備的微膠囊的微膠囊化效率和未經(jīng)交聯(lián)的凍干粉末中LGG 存活率；
[0023] 圖5為微膠囊化和未微膠囊化的LGG在模擬胃液中的存活率；
[0024] 圖6為微膠囊化和未微膠囊化的LGG在模擬腸液中的存活率；
[0025] 圖7為微膠囊和未微膠囊化粉末在4°C條件下貯存的LGG存活率；
[0026] 圖8為微膠囊和未微膠囊化粉末在37°C條件下貯存的LGG存活率；
[0027] 圖9為酸奶貯存期間LGG的存活率。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對(duì)本 發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 濃縮菌懸液的制備：
[0031] 將鼠李糖乳桿菌LGG培養(yǎng)液加入到離心管中，在4°C條件下，6000r/min離心15min 棄上清。菌泥用等體積生理鹽水（0. 9% NaCl溶液）在相同離心條件下洗滌兩次，用原菌液 1/10體積的生理鹽水重新懸浮菌泥，得到十倍濃縮菌懸液。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] LGG微膠囊制備條件的優(yōu)化
[0034] 通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳酶添加量、交聯(lián)時(shí)間、交聯(lián)溫度、交聯(lián)pH。
[0035] 單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1-4,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，回歸模型進(jìn)行方差和顯 著性檢驗(yàn)分析見表2。
[0036] 表 1
[0037]
[0038] 表 2
[0039]
[0040] 結(jié)論：利用D