一種用珍貴橙色束絲放線菌制備安絲菌素p-3的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從珍貴橙色束絲放線菌制備安絲菌素 p-3的方法，屬于生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 安絲菌素（Ansamitocin)是從放線菌如珍貴橙色束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum)產(chǎn)生的高細(xì)胞毒性的化合物。安絲菌素的作用機(jī)理是抑制微管蛋白的組裝，從 而抑制細(xì)胞分裂。安絲菌素的細(xì)胞毒性非常強(qiáng)，是傳統(tǒng)化療藥物長(zhǎng)春花堿、甲氨蝶呤和柔紅 霉素的100-1000倍。
[0003] 安絲菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其結(jié)構(gòu)與美登醇相似。珍貴橙色束絲放線菌表 達(dá)的安絲菌素主要包括6種同系物，包括Ρ-1、Ρ-2、Ρ-3、Ρ-3'、P-4和P-4'，其中P-3為其主 要產(chǎn)物，安絲菌素同系物的結(jié)構(gòu)如下式所示。
[0004]
[0005] 安絲菌素具有高效的抗B-16黑色素瘤、惡性毒瘤180及P185肥大細(xì)胞瘤等活 性。經(jīng)過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)變能合成含硫醇的美登素，雖然美登素類化合物因其極強(qiáng)的細(xì)胞毒性而在 腫瘤治療領(lǐng)域受到關(guān)注，但是在美國(guó)的II期臨床研宄表明其具有劑量限制毒性而被排除 臨床應(yīng)用，然而美登素可作為合成抗體偶聯(lián)藥物的"彈頭"，具有令人滿意的療效和較低的 毒副作用，例如，羅氏公司的以DMl作為藥物"彈頭"的trastuzumab emtansine (T-DM1， Kadcyla?)已經(jīng)于2013年2月22日被美國(guó)PDA批準(zhǔn)上市，用于治療乳腺癌。
[0006] 美登素最初是從衛(wèi)矛科、鼠李科、大戟科及苔蘚等高等植物分離得到，但是其在植 物中含量極低，提取的成本高、效率低，同時(shí)由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，化學(xué)全合成也有成本高、收 率低的缺點(diǎn)。因此，通過(guò)微生物發(fā)酵獲得其前體安絲菌素再轉(zhuǎn)化成美登素成為一種經(jīng)濟(jì)高 效的方式。珍貴橙色束絲放線菌表達(dá)的安絲菌素中安絲菌素 p-3的含量最高，由于其活性 高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、疏水性強(qiáng)已于萃取，成為合成美登素的最佳前體。因此通過(guò)放線菌發(fā)酵選擇 性地高表達(dá)安絲菌素 P-3,對(duì)于其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用具有非常重要的意義。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的安絲菌素的制備工藝中，安絲菌素 P-3最高產(chǎn)量是使用基因突 變株 Actinosynnema pretiosum PF4_4(ATCC PTA-3921)在 900L 發(fā)酵罐規(guī)模中 304mg/L， 20mL/250mL 搖床中 435mg/L(CN101103120A，TO03/064610A2)。其他現(xiàn)有技術(shù) US4162940、 US4450234、US4228239、US4331598 以及 US4356265,安絲菌素的產(chǎn)量一般在 12 ~100mg/L， 安絲菌素 P-3所占比例低于70%，并且其中混有不少不希望產(chǎn)生的安絲菌素成分，如N-脫 甲基、20-0-脫甲基和19-脫氯處被修飾的產(chǎn)物，在還原性脫酰作用下這些產(chǎn)物不能合成美 登醇。
[0008] 目前，放線菌發(fā)酵安絲菌素的產(chǎn)量較低，生產(chǎn)成本高，安絲菌素 P-3所占比例低， 并且純化工藝繁瑣，涉及多種劇毒材料的處理，進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)非常困難。此外，在各個(gè)工 藝步驟中還必須確保操作人員的安全。因此，篩選高表達(dá)安絲菌素的菌株或通過(guò)發(fā)酵工藝 優(yōu)化提高選擇性地高表達(dá)安絲菌素 P-3,對(duì)于安絲菌素的規(guī)?；a(chǎn)和促進(jìn)其在抗腫瘤藥 物中的應(yīng)用具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵生產(chǎn)安絲菌素 P-3的方法。
[0010] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是選用高表達(dá)安絲菌素的珍貴橙色束絲放線菌，通過(guò)優(yōu)化 發(fā)酵培養(yǎng)基配方、發(fā)酵條件和補(bǔ)料工藝實(shí)現(xiàn)安絲菌素的高產(chǎn)量，并使其中安絲菌素 P-3所 占比例提尚。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0012] 一種從珍貴橙色束絲放線菌制備安絲菌素 p-3的方法，步驟如下：
[0013] (1)孢子培養(yǎng)：將在20%甘油管冷凍保存的束絲放線菌孢子在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿 劃線培養(yǎng)，25~30°C培養(yǎng)3~9天，至生長(zhǎng)出豐富孢子；
[0014] (2)種子培養(yǎng)：從培養(yǎng)皿刮取孢子，接種于液體種子培養(yǎng)基在25~30°C進(jìn)行培養(yǎng) 30~50h，獲得種子液；
[0015] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于25~30°C發(fā)酵培養(yǎng)， 溶氧控制20%以上，發(fā)酵持續(xù)時(shí)間350~450h ;
[0016] 步驟⑴中所述束絲放線菌優(yōu)選的為珍貴橙色束絲放線菌 ATCC31565(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)；
[0017] 步驟（1)中所述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
[0018] 酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨0.3~1.0%、麥芽浸膏0. 1~0.5%，甘油 0.5~L 5%，瓊脂粉L 5~2. 2%，自然pH;
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中的孢子是在培養(yǎng)溫度為27~29°C條件下，于固體培養(yǎng)基 培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)4~8天后制得的；所述培養(yǎng)皿直徑90mm，所裝培養(yǎng)基15~20mL ;
[0020] 步驟（2)中所述的液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
[0021] 玉米淀粉1~5%，酵母粉0.5~2%，大豆蛋白胨0.5~2%，pH為7.0~8.0 ;
[0022] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中培養(yǎng)溫度為27. 5~28. 5°C，培養(yǎng)時(shí)間為30~40h，優(yōu)選 34 ~38h ;
[0023] 步驟（3)中所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
[0024] 玉米淀粉4~7%，玉米漿干粉1. 5~2. 5%，熱榨豆餅粉1~3%，葡萄糖0. 1~ 1%，Κ2ΗΡ04 ·3Η20 0· 02 ~0· 03%，MgS04 ·7Η20 0· 1 ~l%，CaC030. 3 ~0· 7%，CaC120. 05 ~ 0· 2 %，異丁醇 0· 2 ~0· 5 %，CoCl2 · 6H20 0· 0002 ~0· 001 %，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 0001 ~ 0.0003%，pH 為 6. 8 ~7.5 ;
[0025] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
[0026] 玉米淀粉5%，玉米漿干粉2%，葡萄糖0.5%，熱榨豆餅粉2%，K2HPO 4 · 3H20 0· 025 %，MgSO4 · 7H20 0· 3 %，CaCO3O. 4 %，CaCl2O. 1 %，異丁醇 0· 3 %，CoCl2 · 6H20 0· 0005 %，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 0002 %，pH 為 7· 2 ;
[0027] 步驟（3)中所述的種子液按8~12 %的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培 養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28°C，溶氧控制30%以上，發(fā)酵持續(xù)時(shí)間400~432h ;
[0028] 具體地，步驟（3)中當(dāng)種子液接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基后開(kāi)始補(bǔ)加濃度為20~25% 的葡萄糖溶液，流速0. 4~0. 5mL/L/h，發(fā)酵至48~72h后補(bǔ)加含有20~30 %的葡萄糖和 5~15%熱榨豆餅粉，流速0. 8~I. 2mL/L/h，同時(shí)，開(kāi)始添加異丁醇，添加方式為每24h每 升發(fā)酵液一次性添加1. 5~2. 5mL，直至發(fā)酵結(jié)束；
[0029] 優(yōu)選地，發(fā)酵至48~72h后補(bǔ)加的葡萄糖濃度為23~27%，熱榨豆餅粉濃度為 8~12 %，異丁醇添加方式為每24h每升發(fā)酵液一次性添加1. 8~2mL，直至發(fā)酵結(jié)束。
[0030] 本發(fā)明技術(shù)方案的關(guān)鍵點(diǎn)在于：
[0031] (1)在發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)加的成分中添加熱榨豆餅粉，熱榨豆餅粉的主要成分為不 溶性蛋白，作為長(zhǎng)效氮源可以延長(zhǎng)發(fā)酵周期并大幅提高發(fā)酵后期發(fā)酵液中菌絲的濃度，從 而提高安絲菌素 P-3的產(chǎn)量；
[0032] (2)在補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)中異丁醇的添加方式為流加方式或在某個(gè)特定 時(shí)間一次添加；本發(fā)明改進(jìn)異丁醇的添加方式為每24h每升發(fā)酵液一次性添加1. 8~2mL， 直至發(fā)酵結(jié)束；通過(guò)改進(jìn)異丁醇補(bǔ)加方式，安絲菌素 P-3產(chǎn)量可提高40%以上。
[0033] 本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案之一為：
[0034] 一種從珍貴橙色束絲放線菌制備安絲菌素 P-3的方法，步驟如下：
[0035] (1)孢子培養(yǎng)：將在20%甘油管冷凍保存的束絲放線菌孢子在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿 劃線培養(yǎng)，25~30°C培養(yǎng)3~9天，至生長(zhǎng)出豐富孢子；
[0036] (2)種子培養(yǎng)：從培養(yǎng)皿刮取孢子，接種于液體種子培養(yǎng)基在25~30°C進(jìn)行培養(yǎng) 30~50h，獲得種子液；
[0037] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于25~30°C發(fā)酵培養(yǎng)， 溶氧控制20%以上，發(fā)酵持續(xù)時(shí)間350~450h ;
[0038] 步驟（1)中所述的束絲放線菌為珍貴橙色束絲放線菌ATCC31565 (Actinosynnema pretiosum ATCC31565);所述的固體培養(yǎng)基的組分為酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨 0. 3~1.0%、