利用蛇足石杉細(xì)胞和內(nèi)生真菌共培養(yǎng)富集石杉?jí)A甲的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)石松生物堿技術(shù)，具體地說(shuō)是以植物細(xì)胞培養(yǎng) 技術(shù)為手段，利用蛇足石杉細(xì)胞和內(nèi)生菌共培養(yǎng)富集石松生物堿石杉?jí)A甲，并以高效液相 色譜儀為檢測(cè)工具，對(duì)石杉?jí)A甲和麥角留醇進(jìn)行檢測(cè)，以確定石杉?jí)A甲的最佳收獲時(shí)間及 繼代培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)。
【背景技術(shù)】：
[0002] 石杉?jí)A甲（huperzine A)是石杉科石杉屬植物蛇足石杉中提取出的一種生物堿， 具有高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制活性，可用于治療重癥肌無(wú)力、提高青少年學(xué)習(xí)能力以 及改善老年人記憶功能等，有著極大的市場(chǎng)需求。但蛇足石杉野生資源有限，且石杉?jí)A甲在 全草中含量甚微，長(zhǎng)期采挖野生蛇足石杉必將導(dǎo)致資源的枯竭，另外，石杉?jí)A甲合成成本較 為高昂，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。長(zhǎng)期以來(lái)蛇足石杉和內(nèi)生真菌共存，基于生物模擬效應(yīng)，內(nèi)生真 菌往往能產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性成分，而麥角留醇（ergosterol)又可以作為 真菌生物量的衡量標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)石杉?jí)A甲因其具有環(huán)境友好、生產(chǎn)周期短、可控性強(qiáng) 等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的重視。
[0004] 本發(fā)明避開(kāi)了當(dāng)前愈傷組織誘導(dǎo)法獲取蛇足石杉單細(xì)胞中極難完全去除內(nèi)生真 菌的難點(diǎn)，通過(guò)蛇足石杉細(xì)胞和內(nèi)生真菌共培養(yǎng)來(lái)富集石杉?jí)A甲，再利用高效液相色譜檢 測(cè)培養(yǎng)液中蛇足石杉和麥角留醇的含量，通過(guò)二者的含量變化確定細(xì)胞繼代培養(yǎng)及石杉?jí)A 甲收獲的最佳時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)蛇足石杉細(xì)胞和內(nèi)生真菌的共培養(yǎng)體系來(lái)富集石 杉?jí)A甲的方法，細(xì)胞的收獲時(shí)間由石杉?jí)A甲和麥角留醇的相對(duì)含量決定。這對(duì)蛇足石杉自 然資源的保護(hù)和石杉?jí)A甲的開(kāi)發(fā)利用及實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)有十分重要的理論意義和實(shí)用價(jià) 值。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] (1)生產(chǎn)有效生物堿的蛇足石杉人工馴化培養(yǎng)：用于栽培蛇足石杉的土壤組成為 蘭花土 ：河沙=2 : 1，土壤pH約為7;保持蛇足石杉的生存環(huán)境濕度在95%以上；保持蛇 足石杉的生存環(huán)境光照在IOOLx左右；首次將苔蘚用于馴化培養(yǎng)中，將苔蘚鋪于土壤表面， 優(yōu)勢(shì)在于苔蘚起到保濕作用，且維持了一個(gè)良好的生態(tài)環(huán)境。
[0008] (2)蛇足石杉單細(xì)胞獲取：取蛇足石杉葉片，依次用以下方法進(jìn)行表面消毒：70% 酒精5〇8,0.511^/1孔雀石綠81]1；[11，3%雙氧水101]1；[11，無(wú)菌水3次 ；借助于透明膠帶剝離葉 片表面蠟質(zhì)，將葉片貼于經(jīng)紫外滅菌的膠布上，用小刀刮去葉片表面蠟質(zhì)，并用膠帶反復(fù)粘 貼2~3次以剝離蠟質(zhì)；機(jī)械破碎法獲取植物葉肉單細(xì)胞，將已剝離蠟質(zhì)的葉片劃成極小的 小塊，刮下置于碾缽中，加入5~IOmL液體培養(yǎng)基，碾磨1~3min后，將混合懸液通過(guò)雙層 200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，并用少量培養(yǎng)液淋洗濾布，將濾液在2000rpm的轉(zhuǎn)速下離心2min，取沉 淀用培養(yǎng)液再懸浮。
[0009] (3)蛇足石杉-內(nèi)生真菌共培養(yǎng)體系的建立：蛇足石杉單細(xì)胞懸浮液置于24°C恒 溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，約10天左右更換一次液體培養(yǎng)基，所用液體培養(yǎng)基主要成分包括MS基本 培養(yǎng)基，5. 0mg/L2,4-D，1.0 mg/LKT，20.0 g/L 蔗糖，調(diào)節(jié) pH 為 5. 8。
[0010] (4)活細(xì)胞的觀察計(jì)數(shù)：將蛇足石杉懸浮細(xì)胞與中性紅染液按4 : 1的比例混合 染色，靜置15~20min后觀察計(jì)數(shù)。
[0011] (5)石杉?jí)A甲及麥角甾醇的提?。喝∨囵B(yǎng)液5. OmL，置于冰箱冷凍室，反復(fù)冷凍解 凍三次；將培養(yǎng)液及細(xì)胞解凍后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水分，用IOmL甲醇溶解，在30°C下超聲處理 2次，每次20min，其間間隔lOmin，濾過(guò)，得到濾液置于錐形瓶中，濾紙剪碎后加入IOmL甲 醇，按上述方法再次提取，濾過(guò)，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇；用色譜甲醇充分溶解旋 蒸得到的浸膏，轉(zhuǎn)移至西林瓶，甲醇揮發(fā)，得到浸膏；甲醇揮發(fā)后得到的浸膏用ImL色譜甲 醇充分溶解，用〇. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾。
[0012] (6)石杉?jí)A甲及麥角甾醇的檢測(cè)：采用的反相色譜柱為Agilent TC (：18柱，由 美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)，規(guī)格4. 6X 150mm，填料粒度5 μ m，檢測(cè)石杉?jí)A甲的流動(dòng)相為甲 醇：0.08mol/L醋酸銨（25 : 75, v/v)，波長(zhǎng)為310nm，檢測(cè)麥角甾醇的流動(dòng)相為甲醇：水 (95 : 5，v/v)，波長(zhǎng)為282nm，兩者所用流速均為1.000mL/min，溫度均為25°C。其中石杉 堿甲的保留時(shí)間為9. 191min，麥角甾醇的保留時(shí)間為10. 716min。
[0013] (7)分析石杉?jí)A甲含量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)：利用高效液相色譜快速地檢測(cè)培 養(yǎng)體系中石杉?jí)A甲和麥角留醇的含量，得出最佳收獲及繼代培養(yǎng)時(shí)間，以富集石杉?jí)A甲。
[0014] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 1、通過(guò)共培養(yǎng)的方法來(lái)富集石杉?jí)A甲，利用蛇足石杉長(zhǎng)期與內(nèi)生真菌共生的特 點(diǎn)，不對(duì)外植體進(jìn)行徹底的滅菌，使內(nèi)生真菌與植物細(xì)胞平衡生長(zhǎng)，一方面內(nèi)生真菌也能產(chǎn) 生石杉?jí)A甲，富集了產(chǎn)物；另一方面內(nèi)生真菌作為誘導(dǎo)子可促使植物細(xì)胞生成石杉?jí)A甲。
[0016] 2、借助于透明膠帶剝離葉片表面蠟質(zhì)，從而使植物細(xì)胞更易從母體上脫落而游離 出單個(gè)植物細(xì)胞以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。
[0017] 3、用機(jī)械破碎法直接獲取蛇足石杉單細(xì)胞，克服了兩個(gè)缺點(diǎn)：1)因長(zhǎng)期與內(nèi)生菌 共生而完全滅菌極其困難；2)因生長(zhǎng)緩慢而從外植體形成愈傷組織耗時(shí)極長(zhǎng)。
[0018] 4、采用活體染色法，方便地辨認(rèn)活細(xì)胞，確定懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。
[0019] 5、取樣后立刻將培養(yǎng)液超聲20min，并放入冰箱冷凍，有利于細(xì)胞的破碎并阻止了 細(xì)胞和細(xì)菌的生長(zhǎng)，保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
【附圖說(shuō)明】：
[0020] 圖1為石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品與共培養(yǎng)體系提取液高效液相色譜對(duì)照?qǐng)D；
[0021] 圖2為麥角留醇標(biāo)準(zhǔn)品與共培養(yǎng)體系提取液高效液相色譜對(duì)照?qǐng)D；
[0022] 圖3為24天培養(yǎng)周期內(nèi)石杉?jí)A甲和麥角甾醇的含量變化曲線；
[0023] 圖4為24天培養(yǎng)周期內(nèi)石杉?jí)A甲活細(xì)胞數(shù)量變化曲線；
[0024] 圖5為共培養(yǎng)體系前7天石杉?jí)A甲含量變化曲線。
【具體實(shí)施方式】：
[0025] 下面結(jié)合色譜圖，最本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0026] 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥：Agilent 1100系列高效液相色譜儀由美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)， 對(duì)照品石杉?jí)A甲和麥角留醇均購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；石杉?jí)A甲-內(nèi)生真菌 培養(yǎng)物由申請(qǐng)人提供；HPLC分析色譜純?cè)噭杭状?、純凈水?. 08mol/L醋酸銨溶液；提取 用分析純?cè)噭杭状肌?br>[0027] 色譜條件：色譜柱為Agilent TC (：18柱，由美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)，規(guī)格 4· 6X 150mm，填料粒度5 μπι，流速為L(zhǎng) 000mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)石杉?jí)A甲為310nm，麥角甾 醇為282nm，柱溫為25°C，石杉?jí)A甲流動(dòng)相為甲醇：0· 08mol/L醋酸銨（25 : 75, v/v)，麥角 甾醇流動(dòng)相為甲醇：水（95 : 5, v/v)。
[0028] 制定標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)兩種成分對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)含量，采用外標(biāo)法，準(zhǔn)確定量石杉?jí)A 甲-內(nèi)生菌培養(yǎng)體系中石杉?jí)A甲及麥角甾醇的含量。精密稱取石杉?jí)A甲、麥角甾醇5mg制成 100 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取不同體積的該標(biāo)液配成5,10,15, 20, 25, 30, 35,40,45 μ g/ mL系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取以上各濃度的對(duì)照品溶液10 μ L進(jìn)樣，按上述色譜條件分 別測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制石杉?jí)A甲和麥角留醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各 自的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。
[0029] 精確度試驗(yàn)：取5 μ g/mL的石杉?jí)A甲對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算RSD ;
[0030] 重復(fù)性試驗(yàn)：取培養(yǎng)液提取物重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算峰面積的RSD ;
[0031] 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取培養(yǎng)液提取物分別在l，2,4,8，12h進(jìn)樣，計(jì)算峰面積的RSD ;
[0032] 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：將0. 5mL標(biāo)準(zhǔn)品加入到1.0 mL培養(yǎng)液提取物中，重復(fù)進(jìn)樣5次， 計(jì)算加樣回收率實(shí)驗(yàn)及其RSD。
[0033] 方法學(xué)考察結(jié)果如下所示：
[0034]
[0035] 實(shí)施例一
[0036] 1.蛇足石杉人工馴化培養(yǎng)條件的優(yōu)化：蛇足石杉植株來(lái)源-福建省。將同一批蛇 足石杉植株隨機(jī)分栽在四個(gè)花盆里，每個(gè)花盆三株植株。分別探宄土壤比例和有無(wú)鋪苔蘚 對(duì)其生長(zhǎng)狀況的影響，并用濕度計(jì)分別測(cè)量其土壤的濕度、PH和光照強(qiáng)度。所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如下表所示：
[0037]
[0038] 通過(guò)表格歸納，確定蛇足石杉人工馴化培養(yǎng)條件為：用于栽培蛇足石杉的土壤組 成為蘭花土 ：河沙=2 : 1，土壤pH約為7;保持蛇足石杉的生存環(huán)境濕度在95%以上；保 持蛇足石杉的生存環(huán)境光照在IOOLx左右。從實(shí)驗(yàn)中可以看出，苔蘚對(duì)于蛇足石杉的生長(zhǎng) 狀況十分重要，原因可能在于將苔蘚鋪于土壤表面，苔蘚起到保濕作用，且維持了一個(gè)良好 的生態(tài)環(huán)境。
[0039] 2.蛇足石杉-內(nèi)生真菌共培養(yǎng)體系的建立：隨機(jī)取蛇足石杉葉片80片，用軟毛刷 和洗滌劑清洗表面，然后帶入超凈工作臺(tái)，依次用以下方法進(jìn)行表面消毒：70%酒精50s， 0. 5mg/L孔雀石綠8min，3%雙氧水lOmin，無(wú)菌水3次。將葉片貼于經(jīng)紫外滅菌的膠布上， 用小刀刮去葉片表面蠟質(zhì)，并用膠帶反復(fù)粘貼3次以剝離蠟質(zhì)，將已剝離蠟質(zhì)的葉片劃成 極小的小塊，刮下置于已滅菌的研缽中，加入IOmL液體培養(yǎng)基，碾磨3min后，將混合懸液 通過(guò)雙層200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，并用少量培養(yǎng)液淋洗濾布，將濾液在2000rpm的轉(zhuǎn)速下離心 2min，取沉淀用培養(yǎng)液再懸浮。所用液體培養(yǎng)基主要成分包括MS基本培養(yǎng)基，