用于區(qū)分奶中細(xì)胞負(fù)載的方法和裝置的制造方法
【專利說明】用于區(qū)分奶中細(xì)胞負(fù)載的方法和裝置
【背景技術(shù)】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于通過阻抗微流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分原料奶樣品中細(xì)胞和其它顆粒， 以及細(xì)胞不同類型的方法。
[0002] 在限定奶質(zhì)量的許多參數(shù)中，細(xì)菌（BCC)和體細(xì)胞計(jì)數(shù)（SCC)是最為重要的，因?yàn)?它們顯著影響所獲得的奶產(chǎn)品的質(zhì)量，而且還提供有關(guān)奶牛健康狀況的信息。
[0003] 體細(xì)胞是被稱為白細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的白血細(xì)胞， 并來源于動(dòng)物的乳房。這些細(xì)胞的數(shù)目可響應(yīng)于細(xì)菌感染而增加，這可以導(dǎo)致乳腺炎。通 常，未感染奶牛的奶具有小于1〇〇, 〇〇〇個(gè)細(xì)胞/毫升，高于300, 000個(gè)細(xì)胞/毫升的值表示 感染的奶牛，而對于患病的奶牛超過1，〇〇〇, 〇〇〇個(gè)細(xì)胞/毫升的值是典型的。對于人類食用 或?qū)τ谶M(jìn)一步加工為供人類食用的食品的閾值在歐洲低于400, 000個(gè)細(xì)胞/毫升，但在美 國可以更高。一般情況下，SCC高于300, 000個(gè)細(xì)胞/毫升的奶牛視為被感染（Smith，K.L.， in STANDARDS FOR SOMATIC CELLS IN MILK :PHYSIOLOGICAL AND RE⑶LATORY(1996)， International Dairy Federation Mastitis Newsletter，9月，第7 頁）。因此，為了評價(jià)奶 質(zhì)量，可靠和精確的體細(xì)胞計(jì)數(shù)方法是必需的。簡單且經(jīng)常被使用的牛側(cè)加利福尼亞乳腺 炎測試（在EXPERIMENTS AND OBSERVATIONS LEADING TO DEVELOPMENT OF THE CALIFORNIA MASTITIS TEST，Journal of the American Veterinary Medical Association (1957)： 130,199-204中根據(jù)它的發(fā)明人Schalm和Norlander也稱為Schalm測試）是間接的、定性 的方法，并且沒有提供這種詳細(xì)信息以定性人類食用奶的質(zhì)量。
[0004] 通常，在卸載奶卡車后在乳制品制造商的實(shí)驗(yàn)室，每天對來自許多動(dòng)物而不是來 自個(gè)別奶牛的混合奶進(jìn)行SCC測量。主要原因是因?yàn)槊看螖D奶時(shí)的個(gè)別動(dòng)物的測試將過 于昂貴。這也意味著，來自患病奶牛的奶會(huì)被健康動(dòng)物稀釋并且平均下來。因此，患病動(dòng) 物可能在后期仍然不被檢測到或發(fā)現(xiàn)是生病的，而不影響整體的奶質(zhì)量評價(jià)。此外，也由 于幾個(gè)農(nóng)場主的奶混合在一起，所以根據(jù)奶負(fù)載的平均評價(jià)補(bǔ)償農(nóng)場主。然而，乳制品制 造商寧愿根據(jù)每個(gè)農(nóng)場主的奶的每日配送質(zhì)量補(bǔ)償每個(gè)農(nóng)場主，這目前這是不可行的。昂 貴的分析主要涉及到基于光學(xué)或電氣測量的現(xiàn)有技術(shù)。光學(xué)測量首先需要在分析前將細(xì) 胞標(biāo)記，因此這通常需要昂貴的化學(xué)試劑或耗材。另一方面，電氣測量，是基于阻抗分析， 但是，利用阻抗分析，其它非細(xì)胞奶顆粒會(huì)干擾，并且必須通過幾個(gè)離心步驟被去除。因此 這些器件不能在農(nóng)場主的場地使用。因此，要進(jìn)行許多努力以簡化分析方法和降低分析成 本。無標(biāo)記技術(shù)是優(yōu)選的方法，因?yàn)檫@些技術(shù)通常不需要試劑和耗材，并且同時(shí)簡化了樣品 制備過程。迄今所使用的電動(dòng)工具是所謂的庫爾特計(jì)數(shù)器，它可以計(jì)數(shù)細(xì)胞并且通過大小 區(qū)分它們。因?yàn)樵夏讨泻性S多顆粒，主要是與白細(xì)胞（5-10微米）具有類似尺寸的脂 肪囊泡，可靠的細(xì)胞計(jì)數(shù)是不可能的，因?yàn)檫@些顆粒容易多于體細(xì)胞，并且因此嚴(yán)重干擾測 量。因此，在測量前這些顆粒必須從體細(xì)胞中分離出來。這可以通過離心實(shí)現(xiàn)，離心時(shí)細(xì)胞 被沉淀而脂肪囊泡從上清液中被除去，或者，如最近由Grenvall等人于2012年10月18日 在 Cytometry A 上在線發(fā)表的 LABEL-FREE SOMATIC CELL CYTOMETRY IN RAW MILK USING A⑶ST0PH0RESIS(2012)中顯示的，采用聲波技術(shù)使脂肪囊泡與體細(xì)胞分離。雖然離心通常 需要實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)設(shè)施，聲泳似乎更有前景，但也使庫爾特計(jì)數(shù)器技術(shù)進(jìn)一步復(fù)雜化。
[0005] 傳統(tǒng)庫爾特計(jì)數(shù)器采用直流（DC)或低頻交流電流（AC，最大1千赫茲）測量阻 抗，允許可靠的細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞大小區(qū)分。這種技術(shù)已經(jīng)在過去十年中通過微技術(shù)的問 世而得到改進(jìn)。EP 1 335 198 Bl公開了具有電極配置的微流體方法，其允許覆蓋寬頻率 范圍（100千赫-20兆赫）的細(xì)胞阻抗分析。高頻分析超出了簡單的細(xì)胞計(jì)數(shù)和分選并 且探詢細(xì)胞的介電特性，其允許在各種應(yīng)用中的細(xì)胞區(qū)分，諸如Schade-Kampmann等人在 標(biāo)題為 ON-CHIP NON-INVASIVE AND LABEL-FREE CELL DISCRMINATION BY MPEDANCE SPECTROSCOPY，Cell Prolif. (2008)，41，830-840 中顯示的細(xì)胞差異，或 Pierzchalski 等 人在標(biāo)題為 LABEL-FREE HYBRIDOMA CELL CULTURE QUALITY CONTROL BY A CHIP-BASED MPEDANCE FLOW CYTOMETER，Lab Chip (2012)，12 (21)，4533-4543 中以及 David 等人在標(biāo) 題為 VIABILITY AND MEMBRANE POTENTIAL ANALYSIS OF BACILLUS MEGATERIUM CELLS BY MPEDANCE FLOW CYTOMETRY， Biotechnology&Bioengineering(2012)，109(2)，883-492 中 分別描述的動(dòng)物和細(xì)菌細(xì)胞生存力。與其中信號幅值是用于計(jì)數(shù)和依大小分選細(xì)胞的傳統(tǒng) 庫爾特計(jì)數(shù)器測量相反，高頻分析提供額外的信息，即使這些細(xì)胞具有相同的尺寸。但是， 這種分析還只在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中實(shí)施，其中細(xì)胞懸浮于明確定義的介質(zhì)中。
[0006] 美國專利2012/0310541 Al中已經(jīng)公開了在巨大頻率范圍（0.3兆赫-1.4千兆 赫）采用阻抗分析用于分析奶中各種細(xì)胞參數(shù)的方法。在100兆赫至2千兆赫之間的射頻 范圍以各種頻率對奶的阻抗測量可以提供關(guān)于體細(xì)胞濃度的指征，但是在一個(gè)相對定性的 水平，因?yàn)樵摲治霾皇窃趩渭?xì)胞水平進(jìn)行的。該方法不夠靈敏，不足以以能夠用于評價(jià)奶質(zhì) 量的方式確定SSC。
[0007] 預(yù)期的是奶顆粒（脂質(zhì)囊泡）和體細(xì)胞在它們的細(xì)胞內(nèi)部的介電性質(zhì)方面表現(xiàn)不 同，如同 Cheung 等人在 MPEDANCE SPECTROSCOPY FLOW CYTOMETRY :0N-CHIP LABEL-FREE CELL DIFFERENTIATION，Cytometry A(2005)，65A，124-132 中預(yù)計(jì)的。
[0008] 已經(jīng)顯示，以范圍至多達(dá)0.1 兆赫的頻率對單細(xì)胞的阻抗分析允許分割幅值 和相位角分量并允許將細(xì)胞區(qū)分于非細(xì)胞顆粒以及區(qū)分活/死細(xì)胞（Conrad等人在 IMPEDIMETRIC AND OPTICAL INTERROGATION OF SINGLE CELLS IN A MICROFLUIDIC DEVICE FOR REAL-TIME VIABILITY AND CHEMICAL RESPONSE ASSESSMENT,Biosensors and Bioelecrtronics (2008)，23,845-851中）。但是，用于該分析的器件在測量阻抗信號之前 捕獲單細(xì)胞，并且因此既不適于細(xì)胞密度確定也不適于短時(shí)間段內(nèi)成千上萬個(gè)細(xì)胞的分 析。而且，盡管可以將非細(xì)胞顆粒（聚苯乙烯珠）區(qū)分于細(xì)胞，但對奶顆粒做相同的工作則 需要高很多的頻率，因?yàn)楫?dāng)暴露于電場時(shí)，與聚苯乙烯珠相比，這些脂肪球表現(xiàn)得更類似于 細(xì)胞。
[0009] 因此本發(fā)明的目的是提出一種用于分析奶的簡單且快速的方法和裝置，并且更確 切的是，用于將細(xì)胞區(qū)分于脂質(zhì)囊泡并且以乳品業(yè)和奶生產(chǎn)基地中奶質(zhì)量控制應(yīng)用需要的 準(zhǔn)確性計(jì)數(shù)它們。
[0010] 此問題