樣本分型結(jié)果為 DQB1*06:09〇
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合實(shí)施例對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0022] 本實(shí)施具體以1個(gè)標(biāo)本進(jìn)行HLA-DQBl基因分型為例對本
【發(fā)明內(nèi)容】
做詳細(xì)說明，本 發(fā)明所采用的一種HLA-DQBl基因分型的組特異性引物PCR-SBT方法具體包括以下步驟： 1、制備人基因組DNA，作為后續(xù)步驟的PCR擴(kuò)增模板。
[0023] 取待檢全血200μ1，按照QuickGene DNA whole blood kit S試劑盒說明書提取基 因組DNA，利用分光光度計(jì)測定基因組濃度和純度。
[0024] 2、合成6對擴(kuò)增引物和4條測序引物，具體序列見前述
【發(fā)明內(nèi)容】
中的序列，不再贅 述，將擴(kuò)增引物用純水稀釋至50 ymol/L ; 準(zhǔn)備 LA -Taq 酶（TaKaRa)UOX 緩沖液（TaKaRa)、dNTP (TaKaRa)、Mg2+ (TaKaRa)、純 水，與步驟1所制備的PCR擴(kuò)增模板按表1所述體系配制PCR擴(kuò)增體系： 表1 :步驟2中HLA-DQBl基因 PCR擴(kuò)增體系
上表中，引物1和引物2根據(jù)HLA-DQBl的組特異性來確定，引物1指DQB1*02F、 DQB1*0301F、DQB1*04F、DQB1*05F、DQB1*0601F 和 DQB1*0602F 中的一條，引物 2 指 DQB1*02R、DQB1*0301R、DQB1*04R、DQB1*05R、DQB1*0601R 和 DQB1*0602R 中的一條，應(yīng)成對 選擇。
[0025] 用PCR儀（ABI9700)按以下程序擴(kuò)增： 擴(kuò)增條件：94° C預(yù)變性Imin ;98° C變性10s，68° C退火和延伸5min，30個(gè)循環(huán)； 72° C，10min，擴(kuò)增片段充分延伸； 3、擴(kuò)增產(chǎn)物的雙酶切純化。檢測樣本所擴(kuò)增片段，各取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳，確定擴(kuò)增片段的特異性。在剩余的PCR產(chǎn)物中分別加入蝦堿性磷酸酶（SAP，1 U/μΙ， Lot :M820A，Promega)和核酸外切酶 I (Exo- I，10 U/μΙ，Lot :CK11011B，TaKaRa)，利用蝦 堿性磷酸酶（SAP)的核苷酸Y端去磷酸化功能以及核酸外切酶I (Exo-1)的單鏈特異性 3r -5r核酸外切酶功能，進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物純化。在25μ1擴(kuò)增產(chǎn)物體系中加入SAP 2 μL和 Exo-I 1 μ1，37?酶切 30 min，80°C作用 15 min 酶失活。
[0026] 4、對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序PCR。將步驟3中純化之后的PCR產(chǎn)物中加入2〇μ1純水稀 釋，混勻。將
【發(fā)明內(nèi)容】
中所述的四條測序引物用純水稀釋至濃度為3. 2 ymol/L，以BigDye terminator v3. I sequencing kit (美國ABI公司）試劑按照表2配制反應(yīng)體系： 表2 :步驟4中PCR產(chǎn)物的PCR測序體系
其中測序引物 1 為 DQB1-2F、DQB1-2R、DQB1-3F、DQB1-3R 中任意一條。
[0027] 所測樣本以擴(kuò)增純化的片段1:1稀釋后作為模板，分別進(jìn)行4個(gè)反應(yīng)，用PCR儀 (ABI9700)按以下程序擴(kuò)增：預(yù)變性96°C lmin，DNA雙鏈充分解開；96°C變性10s，50°C退 火5s，測序引物結(jié)合到DNA模板上，60°C延伸4min，延長擴(kuò)增片段，25個(gè)循環(huán)。
[0028] 5、測序擴(kuò)增PCR產(chǎn)物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進(jìn)行純化。將步驟4中測序擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進(jìn)行純化。直接在PCR產(chǎn)物中加入?μL EDTA(1. 25 μ M) 和25μ1醋酸鈉（3Μ)/無水乙醇（I :40)混合液，混勻，3000g離心30min ;去除上清，加入 5〇μ1 75%乙醇，3000g離心10min，去除上清，酒精揮發(fā)后加入1〇μ1甲酰胺溶解，95°C變性 3min，迅速在冰上冷卻。
[0029] 6、將制備好的產(chǎn)物在ABI 3730測序儀上進(jìn)行48孔毛細(xì)管高通量電泳測序，所測 序結(jié)果利用Assign3. 6+軟件進(jìn)行序列比對，確定HLA-DQBl基因型，結(jié)果顯示了檢測樣本 HLA-DQBl的部分序列。圖2-7為本發(fā)明檢測樣本HLA-DQBl基因的部分測序電泳圖譜。圖 中A、G、C、T分別為測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。
[0030] 所以，本發(fā)明所提供的試劑和方法可作為一種獨(dú)立的、應(yīng)用廣泛的鑒定方法，能成 功解決HLA-DQBl位點(diǎn)的準(zhǔn)確分型鑒定問題，有利于提高造血干細(xì)胞移植供受者HLA配型的 準(zhǔn)確性，從而選擇更合適的移植供者，降低移植過程中的排斥反應(yīng)，這對于進(jìn)一步提高器官 移植的成功率和生存率具有重要的意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種HLA-DQBl基因分型的組特異性引物PCR-SBT試劑，其特征在于：所述試劑由用 于擴(kuò)增HLA-DQBl不同等位基因的6對組特異性引物和用于測序分析的4條寡核苷酸測序 引物組成； 所述用于擴(kuò)增的6對組特異性引物為： (1) 擴(kuò)增HLA-DQB1*02組的特異性引物 DQB1*02F:5'-CTCGTCATTCCCTTGAACTG-3' DQB1*02R:5'-AACCACCGGACTTTGATCTG-3'， (2) 擴(kuò)增HLA-DQB1*03:Ol組的特異性引物 DQB1*0301F:5'-TCAAAAGCTTGTGCTCTTTCAG-3' DQB1*0301R:5'-CAGTCCCTCCGAGCTATCAG-3'， (3) 擴(kuò)增HLA-DQB1*03組（除DQB1*03:01外）和DQB1*04組的特異性引物 DQB1*04F:5'-GATGAGGTGAGCACAGTCGG-3， DQB1*04R:5'-CTCCGAGCTATCAGGACTGG-3'， (4) 擴(kuò)增HLA-DQB1*05組的特異性引物 DQB1*05F:5'-ACAGCAGGATTTGTCATTTCA-3' DQB1*05R:5'-GTCCTGTCTCCTCGCACTTC-3'， (5) 擴(kuò)增HLA-DQB1*06:01組的特異性引物 DQB1*0601F:5'-GGAAATACAAGGCAGCAATGA-3' DQB1*0601R:5'-CCTGCTGAGGAGCTGAAGTC-3'， (6) 擴(kuò)增HLA-DQB1*06組（除DQB1*06:01外）的特異性引物 DQB1*0602F:5'-CAAGACTGCCTGGACTTAGG-3' DQB1*0602R:5'-AGGACTGGGATTCAGAGCAA-3' ； 所述4條寡核苷酸測序引物序列如下： DQB1-2F:5'-GGCCSGTGATTCCYCGCAG-3'， DQB1-2R:5'-GGKCRACSMCGCTCACCTC-3'， DQB1-3F:5'-CTTTYCCTGTCTGTTACTGC-3'， DQB1-3R:5'-GGCCCAYARTAACAGAAACTC-3'。2. -種HLA-DQBl基因分型的組特異性引物PCR-SBT方法，其特征在于：包括以下步 驟： (1) 制備人基因組DNA; (2) 提供擴(kuò)增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴(kuò)增人基因組DNA中HLA-DQBl不同等位基因 型序列； (3) 將步驟（2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切純化； (4) 提供測序引物，將步驟（3)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行測序PCR反應(yīng)； (5) 將步驟（4)得到的測序產(chǎn)物進(jìn)行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序； (6) 將步驟（5)獲得的序列通過軟件分析，確定HLA-DQBl等位基因型。3. 如權(quán)利要求2所述的一種HLA-DQBl基因分型的組特異性引物PCR-SBT方法，其特 征在于：所述步驟（2)中的擴(kuò)增引物為權(quán)利要求1中用于擴(kuò)增HLA-DQBl不同等位基因的6 對組特異性引物。4. 如權(quán)利要求2所述的一種HLA-DQBl基因分型的組特異性引物PCR-SBT方法，其特征 在于：所述步驟（4)中的測序引物為權(quán)利要求1中的4條寡核苷酸測序引物。5. 如權(quán)利要求2所述的一種HLA-DQBl基因分型的組特異性引物PCR-SBT方法，其特征 在于：所述步驟（3)中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于HLA-DQB1基因分型的組特異性引物PCR-SBT試劑，它由用于擴(kuò)增的6對組特異性引物和用于測序分析的4條寡核苷酸測序引物組成；本發(fā)明還提供應(yīng)用上述試劑的HLA-DQB1基因分型的組特異性引物PCR-SBT方法，本發(fā)明所提供的試劑和方法可作為一種獨(dú)立的、應(yīng)用廣泛的鑒定方法，能成功解決HLA-DQB1位點(diǎn)的準(zhǔn)確分型鑒定問題，有利于提高造血干細(xì)胞移植供受者HLA配型的準(zhǔn)確性，從而選擇更合適的移植供者，降低移植過程中的排斥反應(yīng)，這對于進(jìn)一步提高器官移植的成功率和生存率具有重要的意義。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104894230
【申請?zhí)枴緾N201510111237
【發(fā)明人】何吉, 朱發(fā)明, 和艷敏, 章偉, 呂杭軍
【申請人】浙江省血液中心
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年3月13日