人類cyp2d6和sult1a1基因多態(tài)性檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人類CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測的試劑盒,尤其涉及一種 快速有效地檢測少量樣本的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 他莫昔芬(Tamoxifen)是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑,可與雌激素競爭雌激素 受體,從而抑制雌激素介導的乳腺癌細胞增殖。1977年在美國獲FDA批準上市,經(jīng)過30年的 臨床應用,被證實可以有效減少乳腺癌的復發(fā),提高患者的生存率。手術(shù)后服用他莫昔芬5 年是雌激素受體(ER)陽性乳腺癌患者輔助內(nèi)分泌治療的金標準。在體內(nèi)他莫西芬的代謝有 多種藥物代謝酶參與,其經(jīng)CYP3A代謝產(chǎn)生的N-去甲基他莫昔芬(N-desmethyItamoxifen) 是主要的代謝產(chǎn)物,約占他莫昔芬初級代謝產(chǎn)物的90 % ;經(jīng)CYP2D6 (細胞色素 P4502D, 家族2,亞家族D,多肽6,細胞色素 P450家族2D6)代謝產(chǎn)生的4-羥基他莫昔芬 (4-hydroxytamoxifen)占他莫昔芬初級代謝產(chǎn)物的10%。N-去甲基他莫昔芬僅能由CYP2D 進一步代謝為 4_輕-N-去甲基他莫昔芬(4-hydroxy-N-desmethyltamoxifen,Endoxifen)。 Endoxifen和4-羥基他莫昔芬與雌激素受體親和力都較強,是他莫西芬在體內(nèi)代謝后的主 要活性成分,可以有效抑制雌激素介導的乳腺癌細胞擴增。
[0003] CYP2D6屬于細胞色素 P450超級家族,參與臨床上約25%藥物的代謝。其編碼基 因位于22號染色體長鏈ql3. 1區(qū)帶,由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成。CYP2D6基因具有高 度多態(tài)性,目前已報道有超過100種不同的等位基因,其編碼的蛋白有酶活性升高、降低、 喪失或不變四種情況,等位基因的多態(tài)性決定了表型的多態(tài)性,按代謝活性可以將表型分 為快代謝(Um)、泛代謝(EM)、慢代謝(PM)和中等代謝(頂)四種類型。亞洲最常見的等位 基因型是CYP2D6*10,突變率約為50%。單個堿基的突變(1000 T)使得CYP2D6*10編碼的 酶不穩(wěn)定,催化藥物的活性降低。研宄證實CYP2D6基因多態(tài)性與他莫西芬治療患者血液內(nèi) 活性成分濃度密切相關,顯著影響患者復發(fā)率和生存期。一項大型研宄結(jié)果顯示,293名接 受治療的乳腺癌患者中,攜帶CYP2D6*10等位基因的T/T型患者與C/T型或C/C型患者相 比,血中4-羥-他莫西芬較低,且臨床結(jié)果較差。美國FDA已于2006年建議患者在接受他 莫昔芬治療前首先對CYP2D6的基因型進行檢測。
[0004] SULT1A1 (磺基轉(zhuǎn)移酶家族,細胞質(zhì)的,苯酚偏好的,成員1,人磺基轉(zhuǎn)移酶1A1)催 化酚類和雌激素類化合物磺基化,介導他莫西芬進一步轉(zhuǎn)化成無活性產(chǎn)物排出體外。等位 基因 SULT1A1*2(638G>A)導致酶活性降低。白種人SULT1A1*1和SULT1A1*2等位基因頻率 分別為65. 5%和33. 2%,中國人為91. 4%和8%,非裔美洲人為47. 7%和29. 4%。Nowell 等發(fā)現(xiàn)用他莫昔芬進行治療的SULT1A1*2突變純合子乳腺癌患者的死亡率是非突變純合 子患者的3倍。攜帶高活性SULT1A1基因女性5年生存率是88%,而攜帶低活性基因女性 只有64%,即使排除了年齡、種族、診斷時病情階段等影響因素,也同樣如此。因此SULT1A1 的多態(tài)性在他莫昔芬的治療中也起著重要的作用。
[0005] 表1 :CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性
[0006]
[0007] 目前針對基因多態(tài)性的檢測方法很多,如直接測序法,焦磷酸測序法,高分辨率溶 解曲線檢測法(High Resolution Melting Analysis,HRM),熒光定量PCR法等。其中最常 見方法為測序法,該方法費用較低,但操作耗時長且靈敏度低;高分辨率溶解曲線法對設備 要求比較特殊,在臨床推廣存在一定的困難;傳統(tǒng)熒光定量PCR法在臨床上應用較為廣泛, 但該方法檢測基因多態(tài)性一般采用Genotyping方法進行檢測,該方法對樣本數(shù)量以及多 態(tài)性分布有一定要求,樣本量少時不能對樣本基因多態(tài)性進行準確檢測。因此,需要建立一 種快速有效的檢測少量樣本的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明目的在于,克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài) 性的檢測試劑盒,以此解決現(xiàn)有基因多態(tài)性檢測技術(shù)中,樣本量少時基因多態(tài)性檢測效果 不理想的問題。本試劑盒可用于高通量、低成本快速檢測CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性, 其靈敏度高,特異性強,可適用于EDTA、檸檬酸鹽抗凝新鮮全血或血漿中提取的人類基因組 DNA的檢測。
[0009] 本發(fā)明提供了一種CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的檢測試劑盒,該試劑盒包括 PCR緩沖液,HotStart Taq酶,UNG酶,2組特異性引物,2組特異性探針和內(nèi)標系統(tǒng)。
[0010] 在本發(fā)明的一些實施方案中,所述2組特異性引物序列分別為SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 與 SEQ ID NO:4 ;SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 與 SEQ ID NO: 7。
[0011] 在本發(fā)明的一些實施方案中,所述2組特異性探針序列分別為SEQ ID NO: 8與SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 11,且所述特異性探針5'端修飾有FAM或VIC,3'端 修飾有NFQ-MGB。
[0012] 在本發(fā)明的一些實施方案中,所述內(nèi)標系統(tǒng)包含內(nèi)標引物和內(nèi)標探針,所述內(nèi)標 引物序列為SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13,所述內(nèi)標探針序列為SEQ ID NO: 14。在一些 實施方案中,所述內(nèi)標探針5'端修飾有R0X,3'端修飾有BHQ2。
[0013] 在本發(fā)明的一些實施方案中,所述檢測試劑盒含有陽性對照液和空白對照液,所 述陽性對照液含有4種質(zhì)粒DNA混合液,所述4種質(zhì)粒DNA分別含有2種不同的CYP2D6等 位基因和2種不同的SULT1A1等位基因,所述空白對照為Tris-HCl緩沖液。
[0014] 本發(fā)明的CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測試劑盒可以簡單快速檢測基因多態(tài) 性,并且所述檢測包括以下步驟:(1)設計并篩選含有CYP2D6和SULT1A1的檢測探針,ARMS 引物,通用引物;⑵從非細胞體系或細胞體系中提取的基因組DNA作為模板DNA ; (3)進行 實時熒光定量PCR擴增:每個樣本的CYP2D6基因多態(tài)性和SULT1A1基因多態(tài)性檢測分2管 進行PCR反應。
[0015] 本發(fā)明CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性檢測試劑盒采用Taqman探針法,建立了在 同一反應管檢測同一基因兩種不同多態(tài)性的多重熒光定量PCR檢測方法,本發(fā)明CYP2D6和 SULT1A1基因多態(tài)性檢測試劑盒采用ARMS引物特異性擴增目的模板與SNP探針特異性檢測 目的模板方法,對特異性檢測同一基因兩種多態(tài)性提供雙重保證,同時引入內(nèi)標系統(tǒng)和UNG 酶防污染系統(tǒng),能更加準確、穩(wěn)定地對樣品進行分型檢測。本發(fā)明的試劑盒具有以下優(yōu)點: 1.可以準確檢測單個樣品的基因型;2.可以準確檢測Ing基因組DNA的基因型;3.針對 CYP2D6和SULT1A1的基因型設計ARMS引物和SNP分型探針,可以特異性擴增識別對應的多 態(tài)性;4.使用熒光定量PCR技術(shù)進行檢測,檢測過程均為閉管反應,顯著降低污染,并且加 入UNG酶防污染系統(tǒng),確保結(jié)果真實可信;5.在同一反應管中檢測同一基因兩種多態(tài)性,操 作簡便,能在90分鐘內(nèi)完成檢測,結(jié)果判讀方法簡單客觀,便于分析。
【附圖說明】
[0016] 圖1是CYP2D6*10C/C純合野生樣本的一個檢測結(jié)果圖;
[0017] 圖2是CYP2D6*10T/T純合突變樣本的一個檢測結(jié)果圖;
[0018] 圖3是CYP2D6*10C/T雜合突變樣本的一個檢測結(jié)果圖;
[0019] 圖4是SULT1A1*2G/G純合野生樣本的一個檢測結(jié)果圖;
[0020] 圖5是SULT1A1*2G/G純合野生樣本的一個檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白,以下結(jié)合 附圖及實施例,對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解,此處所描述的【具體實施方式】僅僅 用以解釋本發(fā)明,并不限制本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明的一個實施方案提供了一種CYP2D6和SULT1A1基因多態(tài)性的檢測試劑盒, 該試劑盒包括PCR緩沖液,HotStart Taq酶,UNG酶,2組特異性引物,2組特異性探針和內(nèi) 標系統(tǒng)。
[0023] 在一些具體實施方案中,所述PCR緩沖液中含有1.0~5. OmM的MgCl2,1.0~ 5. OmM 的 dNTP,即 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 0 ~5. OmM。
[0024] 在一些具體實施方案中,所述2組特異性引物序列為SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3 與 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 與 SEQ ID N0:7;其中 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2與 SEQ ID N0:5、