55] (1)根據(jù)測序數(shù)據(jù)提供的基因 ID號，檢索BRAD數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)基因組序列信息，在 插入突變位點兩側(cè)設(shè)計引物如下：
[0056] 5' 端突變正向引物 PF5 :5' -CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3' ；（如 SEQ ID No. 5 所 示）。
[0057] 5' 端突變反向引物 PR5 :5' -CAAGGGACTCTTTTCCATCATTC-3' ；（如 SEQ ID No. 6 所 示）。
[0058] 3' 端突變正向引物 PF3 :5' -TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3' ；（如 SEQ ID No. 7 所示）。
[0059] 3' 端突變反向引物 PR3 :5'-TACTTAATAGCTGCTGCTTTGAAGC-3' ；（如 SEQ ID Νο·8 所示）。
[0060] 引物的合成委托華大基因有限公司完成。
[0061] (2) PCR 擴增：在 20 μ 1 反應(yīng)體系中，包含 I X TransStart FastPfu buffer ; 20ng 的基因組DNA ;0. 4 μΜ正反向引物；0.25mM dNTPmix ; 1個標(biāo)準(zhǔn)單位的TransStart FastPfu DNA聚合酶（TransGen AP221)。PCR循環(huán)條件：95°C預(yù)變性5分鐘；接著是95°C變性30秒， 58. 5 °C退火30秒，72 °C延伸10秒，35~38個循環(huán)，最后72 °C延伸5分鐘。
[0062] (3) PCR產(chǎn)物的電泳檢測：
[0063] PCR結(jié)束后，取IOylPCR擴增產(chǎn)物加入ΙμL IOXloading buffer，在3%的高分 辨率瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)束后EB染色，自動凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。結(jié)果如圖 1〇
[0064] (4) PCR產(chǎn)物的克隆測序及序列分析
[0065] 電泳確認目的條帶被擴增后，取1 μ I PCR擴增產(chǎn)物加1 μ 1 pEasy-Blunt (TransGen CB101)載體室溫連接10分鐘，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞 Transl-Tl (TransGen :CD501)，轉(zhuǎn)化菌在含Kan 50 μ g/ml的LB固體平板上37°C倒置培養(yǎng) 16小時左右。菌落PCR檢測后挑取陽性克隆委托北京華大基因有限公司進行DNA序列的測 定。
[0066] 測序結(jié)果表明，引物組合PF5/PR5從06-247與Hel02中分別擴增得到150和156bp 條帶，二者測序結(jié)果比對如圖2所示。
[0067] 1. 3功能性標(biāo)記的獲得
[0068] 由于最初引物設(shè)計就是基于06-247與He 102的序列差異，因此得到的四段 序列就是四個標(biāo)記，即耐抽苔06-247中的兩段，一段位于5'-端，片段大小150bp，命 名為5-InDel-W150,如SEQ ID No. 1所示，一段位于3'-端，片段大小133bp，命名為 3-InDel-W133，SEQ ID No. 3所示；另兩段來自極早花突變體材料Hel02,位于5'-端的片段 大小156bp，命名為5-InDel-ml56,如SEQ ID No. 2所示，位于3'-端的片段大小139bp，命 SS3-InDel-ml39，SEQIDNo.4K*。
[0069] 實施例2 :功能性標(biāo)記對不同遺傳背景的大白菜資源的檢測
[0070] (1)大白菜資源各單株基因組DNA提取采用CTAB法，具體操作同實施例1中的 1. 1 ;
[0071] (2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，擴增所用的反應(yīng)體系、擴 增條件同實施例1中1. 2的步驟（2);
[0072] (3)對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，檢測方法同實施例1中1. 2的步驟（3)，檢測結(jié)果 如圖3所示，A是PF5/PR5對16份資源的檢測；B是PF3/PR3對8份資源的檢測結(jié)果。W/m 為野生型/突變體對照。）
[0073] 由圖3可以看出：1號和8號單株的突變類型同Hel02,5'-端和3'-端同時發(fā)生插 入突變；2、3、6號單株5' -端為突變型，3' -端為野生型；4、5、7單株5' -端為野生型，3' -端 為突變型。兩套引物綜合使用，可以實現(xiàn)對資源的精準(zhǔn)鑒定。
【主權(quán)項】
1. 一種與大白菜CCAl基因編碼區(qū)突變相關(guān)的功能性標(biāo)記，其特征在于，包括：與 區(qū)分5'端6bp插入相關(guān)的功能性標(biāo)記，分別命名為5-InDel-W150和5-InDel-ml56， 5-InDel-W150的片段大小為150bp，如SEQIDNo.1所示，5-InDel-ml56的片段大小為 156bp，如SEQIDNo.2 所示； 與區(qū)分3'端6bp插入相關(guān)的功能性標(biāo)記，分別命名為3-InDel-W133和3-InDel-ml39， 3-InDel-W133的片段大小為133bp，如SEQIDNo.3所示，3-InDel-ml39的片段大小為 139bp，如SEQIDNo. 4所示。2. 用于鑒別權(quán)利要求1所述的與大白菜CCAl基因編碼區(qū)突變相關(guān)的功能性標(biāo)記的引 物，其特征在于，用于鑒別5'端6bp插入相關(guān)的功能性標(biāo)記的引物為： 正向引物PF5 :5' -CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3'，如SEQIDNo.5 所示； 反向引物PR5 :5' -CAAGGGACTCTITTCCATCAITC-3'，如SEQIDNo.6 所示； 用于鑒別3'端6bp插入相關(guān)的功能性標(biāo)記的引物為： 正向引物PF3 :5' -TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3'，如SEQIDNo.7 所示； 反向引物PR3 :5' -TACTTAATAGCTGCTGCITTGAAGC-3'；如SEQIDNo.8 所示。3. 權(quán)利要求1所述的與大白菜CCAl基因編碼區(qū)突變相關(guān)的功能性標(biāo)記的篩選方法，其 特征在于，步驟如下： (1) 以長/短日照下大白菜早花自交系Hel02與晚花自交系06-247為材料，提取兩者 基因組DNA; (2) 依據(jù)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)的突變位點，在突變位點兩側(cè)保守區(qū)設(shè)計引物，引物序列分別如 SEQIDNo. 5-SEQIDNo. 8所示，以基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳 檢測； (3) 將擴增產(chǎn)物克隆后進行測序驗證，結(jié)果與全基因組重測序一致，即野生型在靠近編 碼區(qū)5' -端和3' -端的擴增產(chǎn)物分別比突變體少6個堿基。4. 權(quán)利要求1所述的與大白菜CCAl基因編碼區(qū)突變相關(guān)的功能性標(biāo)記在大白菜種質(zhì) 資源鑒定和輔助育種中的應(yīng)用。5. 如權(quán)利要求2所述的引物在大白菜種質(zhì)資源鑒定和輔助育種中的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用方法為：利用權(quán)利要求2所述的引 物對待測個體的基因組DNA進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物采用電泳檢測擴增片段的大小，如果 擴增出150bp和133bp的條帶，則為晚抽薹類型；擴出156bp和139bp的條帶，則為早抽薹 類型；如果同時擴出150/156bp和133/139bp的四條帶，則為雜合型。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，進行PCR擴增的反應(yīng)體系，每20 y 1反應(yīng) 體系中，包含IXTransStart FastPfu buffer ;20ng的基因組DNA ;0.4yM正反向引物； 0? 25mM dNTPmix ;1個標(biāo)準(zhǔn)單位的TransStart FastPfu DNA聚合酶。8. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，PCR循環(huán)條件：95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變 性30秒，58. 5 °C退火30秒，72 °C延伸10秒，35~38個循環(huán)，最后72 °C延伸5分鐘。9. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，電泳檢測采用的是高分辨率瓊脂糖。10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述高分辨率瓊脂糖為3 %的高分辨率瓊 脂糖。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與大白菜CCA1基因編碼區(qū)突變相關(guān)的功能性標(biāo)記，包括：與區(qū)分5'端6bp插入相關(guān)的功能性標(biāo)記，分別命名為5-InDel-W150和5-InDel-m156，5-InDel-W150的片段大小為150bp，如SEQ ID No.1所示，5-InDel-m156的片段大小為156bp，如SEQ ID No.2所示；與區(qū)分3'端6bp插入相關(guān)的功能性標(biāo)記，分別命名為3-InDel-W133和3-InDel-m139，3-InDel-W133的片段大小為133bp，如SEQ ID No.3所示，3-InDel-m139的片段大小為139bp，如SEQ ID No.4所示。本發(fā)明為培育耐抽苔大白菜提供了輔助選擇的工具，同時也可用于大白菜種質(zhì)資源鑒定。本發(fā)明的應(yīng)用可大大簡化篩選手段、縮短轉(zhuǎn)育年限，避免了常規(guī)育種方法中選擇的盲目性。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104894247
【申請?zhí)枴緾N201510267775
【發(fā)明人】張志剛, 趙智中, 李巧云, 王曉, 劉栓桃, 王淑芬, 徐文玲, 劉賢嫻
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月22日