微量起始dna的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法及其所構(gòu)建的高通量測(cè)序文庫(kù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高通量測(cè)序領(lǐng)域，具體而言，涉及一種微量起始DNA的高通量測(cè)序文 庫(kù)構(gòu)建方法及其所構(gòu)建的高通量測(cè)序文庫(kù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 生命體遺傳信息的快速獲得對(duì)于生命科學(xué)的研宄有著十分重要的意義。第一代 測(cè)序儀對(duì)電泳分離技術(shù)的依賴，使其難以進(jìn)一步提高分析的速度和并行化程度，也難以 通過(guò)微型化降低測(cè)序成本。經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn)，21世紀(jì)初，以Roche454技術(shù)、 illumina公司的Genome Analyzer技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測(cè)序技 術(shù)誕生了。第二代技術(shù)大大降低了測(cè)序成本，還大幅度提高了測(cè)序速度并保持了高準(zhǔn)確 性。其中，illumina公司的第一臺(tái)測(cè)序儀于2006年問(wèn)世，之后開發(fā)出來(lái)一系列的測(cè)序儀，如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、Hiseq X等，在準(zhǔn)確性、通量、成本和速度方面表現(xiàn)更優(yōu)秀，而 使其成為全球使用量最大的第二代測(cè)序儀。在第二代測(cè)序平臺(tái)不斷完善的同時(shí)，以對(duì)單分 子DNA進(jìn)行非PCR測(cè)序?yàn)橹饕卣鞯牡谌鷾y(cè)序技術(shù)也初顯端倪。但由于其關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題 尚待解決，目前還未得到廣泛應(yīng)用。
[0003] 近幾年來(lái)，包括人、擬南芥以及水稻等越來(lái)越多的基因組被測(cè)序，全基因組測(cè)序?yàn)?重要基因的克隆、基因的系統(tǒng)進(jìn)化和基因組學(xué)研宄提供了堅(jiān)實(shí)的平臺(tái)。但依然有部分珍貴 物種由于樣本較少獲取難度大，或者個(gè)體較小獲得的基因組濃度較低等原因，得到的基因 組DNA少（低于50ng)，按照目前現(xiàn)有的建庫(kù)流程和方法，建庫(kù)難度非常大。
[0004] 目前針對(duì)低起始量DNA的建庫(kù)方法主要有轉(zhuǎn)座酶建庫(kù)和普通流程建庫(kù)，轉(zhuǎn)座酶建 庫(kù)主要是利用轉(zhuǎn)座酶隨機(jī)切割基因組DNA，并在片段兩端加上接頭，然后進(jìn)行擴(kuò)增建庫(kù)，該 方法是一種高效的低起始量建庫(kù)方法。但這種建庫(kù)方法有一個(gè)較為明顯的缺點(diǎn)，就是其使 用轉(zhuǎn)座酶隨機(jī)切割打斷過(guò)程中易受到樣本中雜質(zhì)的干擾，導(dǎo)致打斷建庫(kù)失敗。而普通流程 建庫(kù)無(wú)法進(jìn)行低于20ng的建庫(kù)，在起始量為50ng時(shí)，在后期擴(kuò)增時(shí)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)較高，需要 達(dá)到18-25個(gè)循環(huán)，文庫(kù)庫(kù)容較低，質(zhì)量較差，且建庫(kù)成功率只有30 %左右。
[0005] 如上所述，轉(zhuǎn)座酶切割打斷建庫(kù)的方法易受到樣本質(zhì)量的影響，導(dǎo)致切割打斷失 敗，基因組無(wú)法正常片段化，在后續(xù)擴(kuò)增中無(wú)法得到有效擴(kuò)增。而普通流程建庫(kù)無(wú)法進(jìn)行低 于20ng的建庫(kù)，在起始量為50ng時(shí)，建庫(kù)成功率為30%，且文庫(kù)質(zhì)量較差，庫(kù)容低，信息分 析結(jié)果顯示片段重復(fù)較高。
[0006] 因此，仍需要對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，以改善現(xiàn)有的微量起始樣本建庫(kù)成功率較低 的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種微量起始DNA的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法及其 所構(gòu)建的高通量測(cè)序文庫(kù)，以改善現(xiàn)有技術(shù)中微量起始樣本建庫(kù)成功率較低的缺陷。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種微量起始DNA的高通量 測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括：步驟Sl，對(duì)樣本DNA進(jìn)行物理打斷，得到片段化DNA ; 步驟S2,對(duì)片段化DNA進(jìn)行末端修復(fù)及加 A，得到修復(fù)DNA ;步驟S3,利用連接增強(qiáng)劑對(duì)修復(fù) DNA進(jìn)行接頭連接，得到帶接頭片段；以及步驟S4,對(duì)帶接頭片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到高通量測(cè) 序文庫(kù)；其中，增強(qiáng)劑為DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。
[0009] 進(jìn)一步地，在步驟S2中，利用高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒中的修復(fù)酶混合物進(jìn)行 修復(fù)，高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒中的修復(fù)酶混合物包括dNTPs、T4DNA聚合酶、T4PNK和 Klenow酶或Taq酶，并在修復(fù)過(guò)程中向修復(fù)酶混合物中添加 dATP。
[0010] 進(jìn)一步地，高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒包括NEB公司的DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、BiOO 公司的DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒或諾唯贊公司的DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。
[0011] 進(jìn)一步地，在修復(fù)過(guò)程中向修復(fù)酶混合物中添加小于等于0. 4 μ I IOOmM的dATP。
[0012] 進(jìn)一步地，在步驟S3之后以及步驟S4之前，構(gòu)建方法還包括對(duì)帶接頭片段進(jìn)行磁 珠純化的步驟。
[0013] 進(jìn)一步地，步驟S4包括：對(duì)連接片段進(jìn)行分步擴(kuò)增，并在每次擴(kuò)增之后增加磁珠 純化的步驟，得到高通量測(cè)序文庫(kù)。
[0014] 進(jìn)一步地，步驟S4包括：對(duì)帶接頭片段擴(kuò)增4~7個(gè)循環(huán)，得到第一擴(kuò)增片段；對(duì) 第一擴(kuò)增片段進(jìn)行〇. 95~1. 20倍體積的磁珠純化，得到第一擴(kuò)增純化片段；對(duì)第一擴(kuò)增純 化片段擴(kuò)增6~9個(gè)循環(huán)，得到第二擴(kuò)增片段；對(duì)第二擴(kuò)增片段進(jìn)行0. 95~1. 20倍體積的 磁珠純化，得到第二擴(kuò)增純化片段；以及利用0. 7~0. 85倍體積的磁珠對(duì)第二擴(kuò)增純化片 段進(jìn)行分選，得到高通量測(cè)序文庫(kù)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種高通量測(cè)序文庫(kù)，該高通量測(cè)序文庫(kù)采用上 述任一種構(gòu)建方法構(gòu)建而成。
[0016] 進(jìn)一步地，高通量測(cè)序文庫(kù)的庫(kù)容為50~500ng。
[0017] 應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過(guò)在接頭連接的步驟中添加具有連接增強(qiáng)作用的小分 子物質(zhì)，利用這些小分子物質(zhì)刺激連接酶的活性中心區(qū)域，使得其連接活性增強(qiáng)，提高接頭 連接效率，使得更多的修復(fù)DNA片段被成功連上接頭序列，進(jìn)而通過(guò)與接頭序列互補(bǔ)的引 物進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而得到了目的擴(kuò)增片段含量更多的高通量測(cè)序文庫(kù)；從而提高了微量起始 量樣本（可低至1~IOng)的測(cè)序成功率及庫(kù)容。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示 意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0019] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中以Ing DNA作為起始DNA所構(gòu)建的文庫(kù)的 插入片段的大小檢測(cè)結(jié)果圖；以及
[0020] 圖2示出了圖1所示的優(yōu)選實(shí)施例所構(gòu)建的文庫(kù)經(jīng)上機(jī)測(cè)序后經(jīng)數(shù)據(jù)分析得到的 不同插入片段占整個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)比例的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相 互組合。下面將結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0022] 針對(duì)【背景技術(shù)】部分提到的現(xiàn)有微量起始樣本建庫(kù)成功率低的技術(shù)問(wèn)題，在本發(fā)明 一種典型的實(shí)施方式中，提供了一種高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括：對(duì)樣本 DNA進(jìn)行物理打斷，得到片段化DNA ;對(duì)片段化DNA進(jìn)行末端修復(fù)及加 A，得到修復(fù)DNA ;利用 連接增強(qiáng)劑對(duì)修復(fù)DNA進(jìn)行接頭連接，得到帶接頭片段；對(duì)帶接頭片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到高通 量測(cè)序文庫(kù)，其中連接增加劑為DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。
[0023] 本發(fā)明的上述文庫(kù)構(gòu)建方法，在上述接頭連接的步驟中通過(guò)添加具有連接增強(qiáng)作 用的小分子物質(zhì)，利用這些小分子物質(zhì)刺激連接酶的活性中心區(qū)域，使得其連接活性增強(qiáng)， 提高接頭連接效率，使得更多的修復(fù)DNA片段被成功連上接頭序列，進(jìn)而通過(guò)與接頭序列 互補(bǔ)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而得到了目的擴(kuò)增片段量更多的高通量測(cè)序文庫(kù)。
[0024] 在上述優(yōu)選的實(shí)施例中，連接增強(qiáng)劑的作用是增加連接酶的連接活性，因而，任何 具有上述活性的試劑均適用于本發(fā)明。在本發(fā)明中，上述連接增強(qiáng)劑優(yōu)選但不僅限于DMSO、 乙醇、乙二醇或甘油。
[0025] 在上述文庫(kù)構(gòu)建方法中，為了進(jìn)一步提高建庫(kù)成功率及穩(wěn)定性，在本發(fā)明一種優(yōu) 選的實(shí)施例中，在利用現(xiàn)有文庫(kù)構(gòu)建試劑盒中的修復(fù)酶混合物進(jìn)行修復(fù)的過(guò)程中，向反應(yīng) 體系中添加 dATP來(lái)進(jìn)行末端修復(fù)加 A。
[0026] 上述優(yōu)選實(shí)施例中，在末端修復(fù)加 A的步驟中，在常規(guī)的用修復(fù)酶混合的基礎(chǔ)上， 通過(guò)在末端修復(fù)加 A步驟中額外增加 dATP的用量，提高了加 A的效率，進(jìn)而得到更多修復(fù) 后3'末端加 A的修復(fù)片段，更多修復(fù)后3'末端加 A的修復(fù)片段經(jīng)后續(xù)接頭連接及擴(kuò)增 步驟，使得所構(gòu)建得到的高通量測(cè)序文庫(kù)具有更多的目的片段，進(jìn)而提高了低起始量樣本 (可低至1~IOng)的測(cè)序成功率及庫(kù)容。
[0027] 由于現(xiàn)有的文庫(kù)構(gòu)建方法大都采用市售試劑盒進(jìn)行上述修復(fù)和加 A步驟，其中 dNTP中dATP以及其他dCTP、dGTP和dTTP的都是按照等比例直接混合而成的產(chǎn)品，而且還 是與修復(fù)酶混合在一起的產(chǎn)品。比如NEB公司的DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、Bioo公司的DNA文 庫(kù)構(gòu)建試劑盒或諾唯贊公司的DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。也就是說(shuō)，通常在進(jìn)行該步操作時(shí)，不 會(huì)對(duì)其中的dNTP或者某一種脫氧核糖核苷酸的用量進(jìn)行特意調(diào)整，而是直接采用試劑盒 中的推薦用量，或者將修復(fù)酶混合物作為一個(gè)整體在用量上進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
[0028] 而在本發(fā)明中，發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在采用試劑盒或者按照現(xiàn)有的dNTP和dATP的用 量在進(jìn)行上述步驟時(shí)，額外增加 dATP