類糖鞘脂化合物及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種類糖鞘脂化合物及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 糖鞘脂（glycosphingolipid)是糖脂的一種，由寡糖和神經酰胺兩部分組成，疏水 部分神經酰胺由鞘氨醇的氨基被脂肪酸酰化而成，親水部分寡糖的還原末端與鞘氨醇的伯 羥基相連。構成糖鞘脂寡糖的單糖有葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳 糖胺、唾液酸等6種，這些單糖連接形成多種寡糖，疏水脂肪鏈的長短等也存在變化，從而 組成了成員眾多的糖鞘脂家族。
[0003] 糖鞘脂主要分布在哺乳動物細胞膜脂雙層結構中，疏水的長脂肪鏈埋在外側脂層 中，親水的糖鏈伸展到胞外水相中。作為真核細胞膜的重要組成之一，糖鞘脂不僅維持細胞 的正常結構，也參與細胞的社會行為。隨著生物技術和分析測試技術的快速發(fā)展，多種糖鞘 脂的結構和生物學功能得到進一步明確，在細胞分裂、信號轉導、細胞識別、癌癥、免疫、炎 癥、微生物感染等眾多生命過程和疾病形成過程中，糖鞘脂都扮演著非常重要的角色。因 此，獲得結構明確的糖鞘脂，對于糖鞘脂的生物學研究和相關疾病的新藥研發(fā)具有重要意 義。
[0004] 目前市場上可以獲得的糖鞘脂主要來自天然（如牛腦、海綿等)，但天然產物的分 離、純化和結構鑒定難度較高，得到的糖鞘脂種類和數量有限，而且可能帶來潛在的朊病毒 或其它感染源的污染，而人工合成可以避免這些缺點，是實現糖鞘脂或類糖鞘脂化合物快 速、規(guī)?；苽涞陌l(fā)展趨勢，也是糖生物學研究領域中的一個重要學科增長點。
[0005] 化學合成是通過人工合成獲得結構確定的糖鞘脂的重要途徑。1961年報道了首 例糖鞘脂--半乳糖神經酰胺的全合成，自此，已經合成了 Gb3 (注：Gb3為國際通用的糖鞘 脂名稱，下同)、iGb3、Lex抗原、GM 3等許多種不同類型糖鞘脂或類糖鞘脂化合物，合成技術趨 于簡單化、快速化。迄今為止，合成策略通常由寡糖合成開始，然后將寡糖作為糖基供體和 神經酰胺的伯羥基經糖苷化反應來構建糖鞘脂分子。由于糖鞘脂結構復雜、反應官能團多， 糖基供體和神經酰胺伯羥基之間的糖苷化反應要嚴格控制區(qū)域選擇性，因而需要繁雜的保 護、脫保護及糖基還原端活化的操作，導致合成步驟多、總產率低，所發(fā)展的合成方法也只 能針對個別種類的糖鞘脂。
[0006] 酶促合成是通過人工合成獲得結構確定的糖鞘脂的另一途徑。由于尚未獲得生物 體內負責將糖基轉移到神經酰胺上的關鍵酶，糖鞘脂的酶促合成無法照搬體內的生物合成 途徑。且酶的來源有限及酶識別底物的高度特異性嚴重制約了其通用性。
[0007] 綜上所述，天然糖鞘脂的人工合成需要較高的實驗技巧，在實施關鍵步驟--糖 基和神經酰胺伯羥基之間的連接時，必須通過繁雜的保護與脫保護(化學方法)、糖苷酶改 造(酶促方法）及糖基還原端活化來實現糖苷化反應中區(qū)域選擇性的控制，神經酰胺的合成 也是一個非常復雜的過程，特別是烯鍵和仲羥基構造難度較大。因此，關于天然糖鞘脂的全 合成雖然屢見報道，但尚未建立起效率高、通用性好的合成方法。
[0008] 由于結構確定的天然糖鞘脂不易獲得，借助比較易于合成的糖鞘脂類似物或類糖 鞘脂（neoglycospingolipid)"間接"進行糖鞘脂生物學功能研究的思路受到重視。糖鞘脂 的生物學功能主要由糖基、酰胺鍵、脂肪鏈協同決定，而鞘氨醇上的仲羥基則是提高糖鞘脂 水溶性的關鍵，因此類糖鞘脂一定要具備上述四種基本結構，以便盡可能好地模擬天然糖 鞘脂的生物學功能。這是設計類糖鞘脂分子結構的基本出發(fā)點。
[0009] 目前類糖鞘脂的設計與合成主要有兩個方向：（1)用容易獲得的神經酰胺類似物 替代天然結構的神經酰胺，從而省去復雜的神經酰胺合成過程，與天然糖鞘脂相比，縮短了 鞘氨醇脂肪鏈，但活性卻未改變；（2)改變糖鞘脂中糖基與神經酰胺的糖苷鍵類型。在保留 糖基、酰胺鍵、脂肪鏈和鞘氨醇上的仲羥基等關鍵基團的基礎上，對糖鞘脂的結構進行適當 修飾，可以維持甚至改善其生物活性，這為我們進行類糖鞘脂分子結構設計提供了基本依 據。
[0010] 但目前在類糖鞘脂的合成中，糖基與神經酰胺類似物連接時采用的方法與天然糖 鞘脂相同，需要糖上羥基的保護、脫保護及還原端活化等繁雜操作，合成效率低，通用性差 等缺點依然存在。與天然糖鞘脂的人工合成一樣，高效且便于規(guī)模化制備的類糖鞘脂合成 方法也未建立，制約了糖鞘脂的生物學研究和相關疾病防治藥物的開發(fā)。

【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種類糖鞘脂化合物及其制備方法與應用。
[0012] 本發(fā)明提供的類糖鞘脂化合物，其結構通式如式I所示，
[0015] 具體的，所述式I所示化合物為如下化合物中的任意一種：[0016]
[0013]
[0014] 所述式I中，R為
[0017] 本發(fā)明提供的制備所述式I化合物的方法，包括如下步驟：將糖類化合物和式II 所示化合物混合進行反應，反應完畢得到所述式I化合物；
[0018]
[0019] 所述式II中，R為- _ 9
[0020] 所述糖類化合物為D-(+)-葡萄糖、D-(+)-半乳糖、D-乳糖一水合物、D-麥芽三糖 或GM3三糖；
[0021] 其中，D-(+)-葡萄糖的結構式如
[0022] D_(+)_半乳糖的結構式如下
[0023] D-乳糖一水合物的結構式如下：

[0026] 上述方法中，所述糖類化合物和式II所示化合物的投料摩爾比為2-5 :1，具體為 3:1;
[0027] 所述反應步驟中，溫度為30_60°C，具體為45°C，時間為6-18小時，具體為8小時；
[0028] 所述反應在由pH值為3-5的由N，N-二甲基甲酰胺和冰醋酸組成的混合液中進 行；所述pH值具體為3. 7。
[0029] 另外，本發(fā)明還提供了一種制備上述式I所示化合物中所用的中間體化合物，也 即式Π 所示化合物，
[0030]
[0031] 所述式 11 中，R 為-CH2C17H35 苺
[0032] 本發(fā)明提供的制備上述式II所示化合物的方法，包括如下步驟：
[0033]擔
溶于乙酸乙酯后通入氯化氫氣體直至飽和，進行還原反應，反應 完畢得到所述式II所示化合物；
[0034] 所述-Boc為叔丁氧羰基。
[0035] 上述方法還原反應步驟中,溫度為常溫,時間為0. 5-3小時,具體為1小時。
[0036] 另外，上述本發(fā)明提供的式I所示化合物在制備增強黑色素瘤細胞中MMP-9表達 的產品中的應用及在制備抑制黑色素瘤細胞遷移的產品中的應用，也屬于本發(fā)明的保護范 圍。
[0037] 本發(fā)明以N-甲基氨氧基乙酸作為Linker，首先使Linker的羧基與神經酰胺的伯 羥基進行酯縮合生成含有N-甲基氨氧基的神經酰胺衍生物，用不同的寡糖直接與該衍生 物的氨氧基(活化的二級胺）縮合并環(huán)化得到各種類糖鞘脂。該方法中Linker的巧妙設計 與導入可以使無保護基、無活化基的自由寡糖直接反應，從根本上摒棄目前類糖鞘脂合成 中繁雜的糖基保護、脫保護、還原端活化等操作，展露出通用性的前景；合成的類糖鞘脂在 結構上保留了天然糖鞘脂基本骨架(糖基+神經酰胺)，使其盡可能好地模擬天然糖鞘脂的 生物學功能，為后續(xù)研究提供保障和支撐。
【附圖說明】
[0038] 圖1為式I所示化合物對B16細胞中MMP-9表達的影響。
【具體實施方式】
[0039] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。所 述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑而得。
[0040] 下述實施例中所用起始反應物的制
備方法如下：
[0042] 化合物6
合成
[0043] 將 2. Og (10. 5mmol)
化合物 5 (購買自 Acros Organics，CAS : 42989-85-5,貨號：433444)，5. 7g(2L Ommol)十八醇，2. Og (16. 8mmol) DMAP (4-二甲氨基吡 啶）溶于150ml干燥的DCM溶劑中并冷卻至(TC ;再將4. 8g(25. ImmoDWSC溶于60ml干燥 DCM溶劑中，于0°C緩慢滴加至上述反應液中，(TC反應2h后轉至室溫反應5h ;反應完畢后 減壓蒸去DCM溶劑，采用硅膠柱層析Vwm =Vilgiii=IO :1分離得4. 2g白色粉末狀固體10， 收率90%。
[0044] Mp:55 ~56°C I1H NMR(O)3OD, 300MHz) δ :〇· 88(3H，J=6. 2Hz，CH3), I. 26(s，30H，15 XCH2)，I. 48 (s，9H，BocH)，I. 61 ~I. 68 (m，2H，CH2)，4. 18 (t，2H，J=6. 7Hz，COOCH2)，4. 43 (s，2H ,OCH2CO) ; 13C NMR (CDCl3, 100MHz) δ :14. 09 (CH3) ,22.67, 25. 81，28. 51，29. 19,29.34,29.47 ,29. 54, 29. 64, 29. 67, 31. 91 (16 X CH2), 28. 15, 65. 36, 72. 51, 82. 06 [(CH3)3C], 156. 15(C0NH 0), 169. 69 (OCH2COO) ;ESIMS m/z calcd. for C25H49NNaO5[M+Na] +:466. 4, found:466. 4.
[0045] 化合物7的合成
[0046] 將 3. 0g(6. 8mmol)化合物 6 溶于 25ml 干燥的 DMF 溶劑中，加入 308. 3mg(8. 4mmol) NaH (65%)，室溫攪拌20min，再加入505 μ I CH3I,繼續(xù)反應6h ;反應完畢后減壓除去DMF得 黃白色固體，用DCM溶解后再用鹽水洗滌，無水MgSO4干燥，濃縮，采用硅膠柱層析V wm :V &酸^ =20:1 分離得 3. Og 黃色油狀物 7,收率 97%。Mp:40 ~41 °C NMR(CDCl3, 400MHz) δ : 〇· 88 (t，3H，J=6. 8Hz，CH3)，I. 30 (s，30H，15 X CH2)，I. 49 (s，9H，BocH)，I. 64 ~I. 67 (m ，2H，CH2)，4. 16 (t，2H，J=6. 8Hz，COOCH2)，4. 46 (s，2H，OCH2CO)，3. 21 (s，3H，NCH3) ; 13C NMR (CDCl3, 100MHz) δ : 14. 08 (CH3)，22. 66, 25. 81，28. 53, 29. 19, 29. 34, 29. 47, 29. 54, 29. 64 ,29. 67, 31. 90 (16 X CH2), 28. 18, 38. 37 (NCH3), 65. 17, 72. 01, 81. 85 [(CH3)3C], 157. 75 (C0NH 0), 169. 39 (OCH2COO) ;ESIMSm/z calcd. for C26H51NNaO5[M+Na] +:480. 4, found:480. 4.
[0047]
[0049] 將 100.0 mg L-Z-Se:
:0· 42mmol)和 135. 7 (0· 50mmo