狀分子外圍的氨基和\或胍基的保護(hù)基團(tuán)，然后在其上接枝A類基團(tuán)或 B類基團(tuán)中的至少一種，得到pH響應(yīng)型脂質(zhì)材料。
[0067] 作為可選方式，在上述步驟（3)中，可以通過化學(xué)鍵直接將疏水基團(tuán)連接在樹狀 分子的一端，也可以采用具有多官能度的分子作為橋接單元來將疏水基團(tuán)連接到樹狀分子 的一端，如采用谷氨酸通過肽鍵連接到樹狀分子的一端。
[0068] 作為可選方式，所述A類基團(tuán)為
二甲基馬來酸酐基團(tuán)），B類基團(tuán) πη
中的至少一種，在上 述步驟（4)中，將外圍含氨基和\或胍基的樹狀分子脫保護(hù)，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下溶于無水的吡 啶，在冰水浴中加入無水三乙胺（兩種溶液的體積比為1:10~10:1優(yōu)選為1:1)，攪拌混 勻，然后加入與上述A類基團(tuán)或B類基團(tuán)對(duì)應(yīng)的酸酐室溫或者加熱攪拌反應(yīng)（一般在室溫 下反應(yīng)，在反應(yīng)比較困難的情況下可適當(dāng)加熱），對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。進(jìn)一步的，所述分離 純化步驟具體為反應(yīng)結(jié)束后，旋干有機(jī)溶劑，用甲醇將固體初產(chǎn)物重溶，在乙醚中沉淀，得 到粉末狀固體，即為PH響應(yīng)型脂質(zhì)材料。
[0069] 通過上述方法，成功制得只含A類基團(tuán)或只含B類基團(tuán)或同時(shí)含有A類基團(tuán)和B類 基團(tuán)的一系列pH響應(yīng)型脂質(zhì)材料。所得的任意一種pH響應(yīng)型脂質(zhì)材料在中性或堿性水溶 液中可自組裝形成納米尺寸的脂質(zhì)體或膠束或囊泡。當(dāng)改變?nèi)芤旱膒H值至6. 8或5. 5以 下時(shí)，所述自組裝體發(fā)生解組裝，證實(shí)了所述脂質(zhì)材料具有PH響應(yīng)特性。
[0070] 將所得的任意一種pH響應(yīng)型脂質(zhì)材料與疏水性藥物（如阿霉素）一起加入到中 性或堿性水溶液中混勻，可自組裝形成包裹藥物納米尺寸的脂質(zhì)體或膠束或囊泡。得到脂 質(zhì)材料與藥物的混合物。實(shí)驗(yàn)顯示，所得藥物混合物可在中性或堿性條件下穩(wěn)定存在，將所 得藥物混合物干燥后重新分散于去離子水或PH7. 4的磷酸緩沖溶液（PBS)中，浸提7天后 所述去離子水或PBS中仍未見游離的疏水性藥物。當(dāng)改變?nèi)芤旱膒H值至6. 8或5. 5以下 時(shí)，所得藥物混合物可發(fā)生解組裝，釋放出其中包裹的疏水性藥物。
[0071] 實(shí)施例2
[0072] (1)將質(zhì)粒DNA或RNA溶于無菌的HBG緩沖溶液（4-羥乙基哌嗪乙磺酸20毫摩 爾，5%葡萄糖）中，配制成0. lmg/mL的基因溶液；將陽(yáng)離子材料溶于HBG緩沖溶液中，配 制成0. 1~10mg/mL的溶液A ;將實(shí)施例1中制備的任意一種pH響應(yīng)型脂質(zhì)材料分別加入 HBG緩沖溶液中，配制成0. 1~10mg/mL的溶液B ;或?qū)?shí)施例1中制備的兩種分別含A類基 團(tuán)和B類基團(tuán)的pH響應(yīng)型脂質(zhì)材料用乙醇注入法分別加入HBG緩沖溶液中，配制成0. 1~ 10mg/mL的溶液B和C。
[0073] (2)將上述步驟中得到的溶液A與基因溶液混合，在室溫下孵育20分鐘后，得到二 元復(fù)合物，再加入溶液B或，按比例加入溶液B和C，在室溫下孵育20分鐘后，得到三元復(fù)合 物。
[0074] 作為可選，所述陽(yáng)離子載體為本發(fā)明中未經(jīng)pH響應(yīng)型基團(tuán)修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)或 或者商品化的陽(yáng)離子聚合物，本例分別采用聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、精胺、聚賴氨酸、氨基 酸多肽、聚酰胺-胺型樹枝狀高分子、肽類樹狀大分子、含有肽類樹狀大分子的陽(yáng)離子材料 及其衍生物作為陽(yáng)離子材料均成功制得了三元復(fù)合物。
[0075] 作為可選，所述pH響應(yīng)型脂質(zhì)材料與基因的質(zhì)量比例為0. 1:1~50:1，所述陽(yáng)離 子載體與基因的質(zhì)量比例為〇. 1:1~50:1。
[0076] 作為可選，所述步驟（2)中加入的溶液B和C中所含pH響應(yīng)型組裝體的質(zhì)量比例： 0· 1:1 ~10:1〇
[0077] 作為可選，還可在上述步驟（2)中加入藥物或磁性納米粒子制得四元或五元化合 物。
[0078] 實(shí)驗(yàn)表明，所得基因載體可在中性或堿性條件下穩(wěn)定存在，將所得基因載體干燥 后重新分散于去離子水或PH7. 4的磷酸緩沖溶液（PBS)中，浸提24小時(shí)后所述去離子水或 PBS中仍未見游離的基因。當(dāng)改變?nèi)芤旱膒H值至6. 8或5. 5以下時(shí)，所得基因載體可發(fā)生 解組裝，釋放出其中包裹的陽(yáng)離子載體和基因。
[0079] 實(shí)施例3 :檸康酸酐-二代賴氨酸-谷氨酸-正^^一胺（CIT-Lys (G2) -Glu-UA2, CL G2Cn)的制備
[0080] 取1代和2代重復(fù)單元均為賴氨酸的扇形樹狀分子（二代氨基Pbf/Boc保護(hù)），谷 氨酸-正十一胺，縮合劑（如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC，催化 劑1-羥基苯并三唑（HOBt)、堿（N，N-二異丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩爾比，在 〇°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，加入二氯甲烷溶劑，反應(yīng)0. 5小時(shí)；然后室溫反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束 后，所得溶液依次用碳酸氫鈉溶液、硫酸氫鈉溶液和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鎂干燥12 小時(shí)，減壓濃縮，以乙酸乙酯：石油醚=1:1 (體積比）做洗脫劑，柱層析分離得到帶疏水尾 部的樹狀分子（二代賴氨酸-谷氨酸-正十一胺）。
[0081] 取上述帶疏水尾部的樹狀分子I. 2mmol，脫除二代氨基的Pbf/Boc保護(hù)，然后在氮 氣的保護(hù)下溶于無水的吡啶，在冰水浴中加入等量的無水三乙胺，攪拌30分鐘。加入檸康 酸酐（IOmmol)，室溫?cái)嚢?8h。反應(yīng)結(jié)束后，旋干有機(jī)溶劑，用甲醇將固體初產(chǎn)物重溶，在 乙醚中沉淀，得到紅棕色粉末狀固體，檸康酸酐-二代賴氨酸-谷氨酸-正十一胺（I. 20g， 0. 79mmol，79% )。其核磁圖譜分析結(jié)果如下,H-NHUO^ChdOOMHz，ppm) :0.85(t，6H，-C H2CH3), I. 25-1. 43 (m, 24H, -CH2CH2-(mdecanoyl), -CHCH2CH2-(lysine)), I. 53 (q, 6H, -NHCH2CH2-(lysine) ),I. 75 (q, 6H, -CHCH2CH2-(lysine)), 2. 05 (s, 4H, -CHCH2CH2-(glutafflic)), 2. 98 (t, 2H, -NHCH-(glutamic) )，3. 16 (t, 8H, -NHCH-), 3. 34 (s, 12H, -CCH3), 4. 42 (s, 4H, -NHCH-), 7. 18 (s，4H, -CCH-)。MS : [M+H+] = 1286。
[0082] 所得的pH響應(yīng)型脂質(zhì)材料在中性或堿性水溶液中可自組裝形成納米尺寸的脂質(zhì) 體或膠束或囊泡。當(dāng)改變?nèi)芤旱腜H值至5. 5以下時(shí)，所述自組裝體發(fā)生解組裝，證實(shí)了所 述脂質(zhì)材料具有pH響應(yīng)特性。
[0083] 實(shí)施例4 : 丁二酸酐-二代精氨酸-谷氨酸-正十一胺 (SA-Ays (G2)-Glu-UA2, SAG2Cn)的制備
[0084] 取1代重復(fù)單元為賴氨酸，2代重復(fù)單元為精氨酸的扇形樹狀分子，參照實(shí)施例3 中所述的方法制備帶疏水尾部的樹狀分子（二代精氨酸-谷氨酸-正十一胺）。
[0085] 取上述帶疏水尾部的樹狀分子（二代精氨酸-谷氨酸-正十一胺）lmmol，脫除二 代氨基的Pbf/Boc，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下溶于無水的吡啶，在冰水浴中加入等量的無水三乙胺， 攪拌30分鐘。加入二甲基馬來酸酐（IOmmol)，室溫?cái)嚢?8h。反應(yīng)結(jié)束后，旋干有機(jī)溶劑，用 甲醇將固體初產(chǎn)物重溶，在乙醚中沉淀，得到白色粉末狀固體，丁二酸酐-二代精氨酸-谷 氨酸-正十一胺（I. 12g，0.86mmol，86% )。其核磁圖譜分析結(jié)果如下！1H-NMR(O)2Cl2, 400MHz, ppm) ：0. 85 (t, 6H, -CH2CH3), I. 25-1. 33 (m, 24H, -CH2CH2-(undecanoyl), -CHCH2CH2-(lysine)), 1. 55 (q, 6H, -NHCH2CH2-(lysine)), I. 74 (q, 6H, -CHCH2CH2-(lysine)), 2. 05 (s, 4H, -CHCH2CH2-(glutamic) ),2. 45 (16H, -CH2CH2-), 2. 96 (t, 2H, -NHCH-(glutamic)), 3. 16 (t, 8H, -NHCH-), 3. 35 (s, 24H, -CCH 3)，4. 44 (s, 4H, -NHCH-)。MS : [M+H+] = 1294。
[0086] 所得的pH響應(yīng)型脂質(zhì)材料在中性或堿性水溶液中可自組裝形成納米尺寸的脂質(zhì) 體或膠束或囊泡。當(dāng)改變?nèi)芤旱腜H值至5. 5以下時(shí)，所述自組裝體發(fā)生解組裝，證實(shí)了所 述脂質(zhì)材料具有pH響應(yīng)特性。
[0087] 實(shí)施例5 :檸康酸酐-二代賴氨酸-谷氨酸-油胺（CIT-Lys (G2)-Glu-OA2, CLG2C18) 的制備
[0088] 取1代和2代重復(fù)單元均為賴氨酸的扇形樹狀分子（二代氨基Pbf/Boc保護(hù)）， 谷氨酸-油胺，縮合劑（如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC，催化 劑1-羥基苯并三唑（HOBt)、堿（N，N-二異丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩爾比，在 〇°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，加入二氯甲烷溶劑，反應(yīng)0. 5小時(shí)；然后室溫反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束 后，所得溶液依次用碳酸氫鈉溶液、硫酸氫鈉溶液和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鎂干燥12 小時(shí)，減壓濃縮，以乙酸乙酯：石油醚=1:1 (體積比）做洗脫劑，柱層析分離得到帶疏水尾 部的樹狀分子（二代賴氨酸-谷氨