制備的殼聚糖-甘油-納米銀海綿與對比例1所制備的殼聚糖海綿同 時(shí)浸泡在去離子水中。觀察發(fā)現(xiàn)如圖2所示，對比例1的不含甘油和納米銀的殼聚糖海綿與 水接觸的邊緣開始模糊和溶解，而本實(shí)施例所制備的殼聚糖-甘油-納米銀海綿則能將水 分吸收進(jìn)去而沒有溶解。測試表明，通過本發(fā)明方法所制備的殼聚糖-甘油-納米銀海綿， 無需加入堿性溶液或者醛類交聯(lián)劑等方法即可達(dá)到除酸目的，以防止殼聚糖海綿在水中溶 解。
[0034] 實(shí)施例3殼聚糖-甘油-納米銀海綿的抑菌圈試驗(yàn)，包括以下步驟：
[0035] 產(chǎn)品的制備：稱取2. Og殼聚糖，溶于IOOmL濃度為I. 5wt%的醋酸溶液中，完全溶 解后加入2mL甘油和4mg納米銀。將得到的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放入超低溫冰 箱中-80°C預(yù)冷凍lh。待完全凝固后放置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥處理，然后放 置在烘箱中70°C烘干2h得到成品。
[0036] 產(chǎn)品的滅菌包裝：得到的殼聚糖-甘油-納米銀海綿剪裁成直徑lcm(厚度為 0.2cm)的圓形小片，浸泡在去離子水中，并經(jīng)過121°C高壓蒸汽滅菌20min后，在無菌潔凈 空間封裝，得到無菌的殼聚糖-甘油-納米銀海綿產(chǎn)品。另外作為本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)的對照組， 把對比例1的樣品經(jīng)過同樣的方法作剪裁和滅菌處理。
[0037] 將本實(shí)施例所制備的殼聚糖-甘油-納米銀海綿作抑菌圈測試，其中以對比例1 制備的殼聚糖敷料樣品作為對照組，分別測試對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄 球菌、大腸桿菌、多重耐藥大腸桿菌的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，不含納米銀的對比 例1均對以上四種病原菌無抗菌活性，含納米銀的實(shí)施例3則可見敷料周邊有明顯的抑菌 圈。測試表明，通過本發(fā)明方法制備的殼聚糖-甘油-納米銀海綿，對于傷口感染常見的病 原菌（包括耐藥菌株）均有強(qiáng)效的抑菌作用。
[0038] 實(shí)施例4殼聚糖-甘油-納米銀海綿銀釋放試驗(yàn)，包括以下步驟：
[0039] 產(chǎn)品的制備：稱取3. Og殼聚糖，溶于IOOmL濃度為2wt%的醋酸溶液中，完全溶解 后加入2mL甘油和6mg納米銀。將得到的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放入超低溫冰箱 中-60°C預(yù)冷凍2h。待完全凝固后放置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥處理，然后放置 在烘箱中80°C烘干Ih得到成品。
[0040] 對本實(shí)施例制作的產(chǎn)品作銀釋放測試，來說明本發(fā)明所述殼聚糖-甘油-納米銀 海綿中納米銀顆粒的結(jié)合穩(wěn)定性。作為對照樣品，在此還選用了愛可欣納米銀紗布這一商 品敷料作測試。測試方法如下：把本實(shí)施例制作的產(chǎn)品和愛可欣納米銀紗布，均裁剪成質(zhì)量 為20mg的測試樣品，充分浸泡在5mL生理鹽水中并放置在37°C的恒溫環(huán)境中，每隔24h測 量浸液在450nm波長下的吸光值，通過吸光值的變化可以判斷敷料中納米銀的溶出情況。 測試結(jié)果如表1所示。
[0041] 測試結(jié)果表明，通過本發(fā)明方法制備的殼聚糖-甘油-納米銀海綿，其中的納米銀 具有很高的穩(wěn)定性，與商品敷料愛可欣納米銀紗布相比，具有更高的結(jié)合能力，因此也具有 更高的生物安全性。
[0042] 表1 :產(chǎn)品的納米銀溶出試驗(yàn)
[0043]
[0044] 實(shí)施例5殼聚糖-甘油-納米銀海綿治療小鼠背部切割傷的試驗(yàn)，包括以下步 驟：
[0045] 產(chǎn)品的制備：稱取2. Og殼聚糖，溶于IOOmL濃度為lwt%的醋酸溶液中，完全溶解 后加入2mL甘油和2mg納米銀。將得到的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放入超低溫冰箱 中-70°C預(yù)冷凍lh。待完全凝固后放置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥處理，然后放置 在烘箱中70 °C烘干2h得到成品。
[0046] 產(chǎn)品的滅菌包裝：得到的殼聚糖-甘油-納米銀海綿剪裁成直徑lcm(厚度為 0.2cm)的小片，浸泡在去離子水中，并經(jīng)過121°C高壓蒸汽滅菌30min后，在無菌潔凈空間 封裝，得到無菌的殼聚糖-甘油-納米銀海綿產(chǎn)品。
[0047] 使用本實(shí)施例制備的殼聚糖-甘油-納米銀海綿產(chǎn)品進(jìn)行治療小鼠背部切割傷的 試驗(yàn)，來說明本發(fā)明產(chǎn)品的傷口愈合效果。測試方法如下：以健康的BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)對 象，全雄性，6-8周大，體重在20g左右，以5只小鼠為一組，隨機(jī)分為3組，分別為"空白對 照"組、"愛可欣?敷料"（一種已經(jīng)商品化的含納米銀紗布敷料）組以及"實(shí)施例5"組。對 小鼠麻醉后，用手術(shù)刀在背部劃出長約IOmm的傷口，使皮下組織充分暴露。"空白對照"組不 作任何處理，另外兩組分別在傷口表面覆蓋相應(yīng)的敷料并包扎固定。處理傷口后將小鼠根 據(jù)分組放進(jìn)小鼠籠里繼續(xù)飼養(yǎng)，并在術(shù)后若干天觀察小鼠傷口的愈合情況，實(shí)驗(yàn)照片如圖4 所示。從小鼠傷口愈合情況可見，在術(shù)后第8天，使用實(shí)施例5制備的殼聚糖-甘油-納米 銀海綿的小鼠傷口已基本愈合，而另外兩組仍可見明顯的傷口。由此可見，通過本發(fā)明方法 所得到的產(chǎn)品，具有良好的促進(jìn)傷口愈合能力。
[0048] 實(shí)施例6殼聚糖-甘油-納米銀海綿的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，包括以下步驟：
[0049] 將實(shí)施例1-4制備得到的殼聚糖-甘油-納米銀海綿產(chǎn)品裁剪成尺寸均一的圓形 小片，直徑為lcm，對HEK293(人胚腎細(xì)胞）作細(xì)胞毒性測試，具體步驟如下：取處于對數(shù)生 長期且完全貼壁的HEK293細(xì)胞配成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至每ImL含IO 5數(shù)量級的細(xì)胞。在 24孔板中每孔放入一片測試的圓形小片，并加入ImL的細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)；另外配制一組 不加任何樣品只添加 ImL細(xì)胞懸液的空白對照組。用MTT法依次對培養(yǎng)了 1-4天后的細(xì)胞 作存活率測試，具體測試方法：往培養(yǎng)了相應(yīng)天數(shù)的24孔板中加入100 μ L濃度為5mg/mL 的MTT (噻唑藍(lán)）溶液，在37°C下放置6h后吸去多孔板中的液體并加入750 μ L DMSO(二甲 基亞砜），在搖床中以150rpm/min的速度振蕩20min使生成的藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，然后 采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其在490nm波長下的光吸收值。通過與第1天空白對照組的吸收 值相比較算出各組細(xì)胞在培養(yǎng)1-4天后的存活率，由此反映出細(xì)胞活性。結(jié)果如圖5所示， 隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，相對于空白對照組，實(shí)施例1-4組的細(xì)胞均有明顯生長。測試結(jié)果表 明，通過本發(fā)明方法制備的殼聚糖-甘油-納米銀海綿對人體正常細(xì)胞沒有毒性，而且對細(xì) 胞的生長有促進(jìn)作用。
[0050] 可以理解的是，以上實(shí)施方式僅僅是為了說明本發(fā)明的原理而采用的示例性實(shí)施 方式，然而本發(fā)明并不局限于此。對于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明的精 神和實(shí)質(zhì)的情況下，可以做出各種變型和改進(jìn)，這些變型和改進(jìn)也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種殼聚糖-甘油-納米銀海綿的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（1)配制 殼聚糖、甘油、納米銀混合醋酸溶液；（2)超低溫冷凍；（3)真空冷凍干燥成形；(4)加熱處 理即可。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-甘油-納米銀海綿的制備方法，其特征在于，所述的 殼聚糖、甘油、納米銀混合醋酸溶液配比為：每IOOmL濃度為0. 5~2wt%的醋酸溶液中，溶 解有1~3g殼聚糖、1~3mL甘油、0? 5~6mg納米銀。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-甘油-納米銀海綿的制備方法，其特征在于，所述殼 聚糖脫乙酰度為70-100%，粘度為100-200cPa?s。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-甘油-納米銀海綿的制備方法，其特征在于，所述的 超低溫冷凍是將殼聚糖、甘油、納米銀混合溶液置于-50~-80 °C的超低溫冰箱環(huán)境中，冷 凍1~2h，使溶液完全凝固。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-甘油-納米銀海綿的制備方法，其特征在于，所述真 空冷凍干燥成形的條件為：冷凍干燥機(jī)冷阱溫度在-40°C以下，真空度< 10Pa，冷凍干燥時(shí) 間為12h以上。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-甘油-納米銀海綿的制備方法，其特征在于，所述的 加熱處理是將凍干成形的海綿置于65~85°C的烘箱中加熱1~3h。7. 權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)制備方法所得殼聚糖-甘油-納米銀海綿。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的殼聚糖-甘油-納米銀海綿作為傷口敷料或抗菌材料的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物材料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種殼聚糖-甘油-納米銀海綿及其制備方法和相關(guān)應(yīng)用，包括以下步驟：(1)配制殼聚糖、甘油、納米銀混合醋酸溶液；(2)超低溫冷凍；(3)真空冷凍干燥成形；(4)加熱處理即可。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所提供的殼聚糖-甘油-納米銀海綿制備方法簡單，生產(chǎn)周期短，不需要加入醛類或者堿液處理，制作過程不產(chǎn)生廢水廢氣。此外，通過該方法制備得到的殼聚糖-甘油-納米銀海綿，具有良好生物安全性、透氣性、吸水性和抗菌活性，且對正常人體細(xì)胞沒有毒性，在傷口敷料和其它抗菌材料有廣泛的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C08J9/28, A61L15/20, A61L15/28, A61L15/44, A61L15/18, C08J7/00
【公開號】CN104910404
【申請?zhí)枴緾N201510351717
【發(fā)明人】陳嶸, 梁冬暉, 楊浩, 呂中
【申請人】武漢工程大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年6月24日