米曲霉菌株及其在豆醬發(fā)酵中的應用
【專利說明】
[0001](一)技術領域:本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及一株米曲霉(Aspergillusoryzae)Zff2-1及其在豆醬發(fā)酵中的應用。
[0002]( 二)【背景技術】:豆醬是我國傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵豆制品，以其獨特的工藝，細膩的品質，豐富的營養(yǎng)，鮮香可口的風味而深受廣大群眾的喜愛，有良好的市場前景，因而提高豆醬的質量對人類的健康具有重要的意義。米曲霉是豆醬發(fā)酵中常用的菌株，在生產過程中，米曲霉所分泌的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等把原料中的蛋白質、淀粉、纖維素分別水解產生氨基酸、糖類等物質，因此，生產用菌株的酶系分布及活性對豆醬生產中原料氮利用率和風味起著決定性的作用。
[0003]目前在豆醬的生產過程中也存在影響產品品質的不穩(wěn)定因素。如菌株酶系的活力及各組分的協(xié)調性對品質的影響，多關注蛋白酶活力大小而忽視其它酶系；“白點”問題是豆醬產品中最常見的負面感官因子，其雖不影響產品的風味與口感，但影響豆醬的感官品質和消費者的購買欲，對豆醬產品的銷售不利。已有研宄表明，添加乳化劑、抑菌劑，或控制發(fā)酵工藝條件、生產操作等措施可部分減輕“白點”的形成，但是也可能引入一些安全問題，費時費力且產品質量不容易控制。有研宄表明，“白點”的形成是由酪氨酸結晶析出的，而酪氨酸羧肽酶是發(fā)酵過程中酪氨酸產生的關鍵酶。實際生產經驗表明酪氨酸含量低于6.15mg/g干基時，豆醬成品中沒有“白點”出現(xiàn)。因此最根本的解決方法是從菌種角度出發(fā)，通過馴化選育酪氨酸羧肽酶活性低的菌株進行發(fā)酵，以減少酪氨酸的生成，解決豆醬中存在的“白點”問題。本發(fā)明篩選出一株生長旺盛、產孢豐富、酶活性高且各組份活力平衡性好、酪氨酸羧肽酶活性低的、安全優(yōu)質米曲霉菌株，其不僅能提高原材料的利用率、產品出品率，而且能縮短生產周期、降低生產成本，提高豆醬的風味和品質，解決“白點”的產生，對于提尚發(fā)酵調味品的質量和品質具有?米遠的意義。
[0004](三)
【發(fā)明內容】
:本發(fā)明的目的是提供一株適合優(yōu)質豆醬生產的米曲霉菌株，提高提高原材料利用率，降低生產成本，提高豆醬的風味和品質，防止“白點”的產生。
[0005]本發(fā)明所提供的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) ZW2-1，根據對其平板菌落形態(tài)和分生孢子頭形態(tài)特征觀察，及ITS序列比對分析，鑒定該菌株為米曲霉(Aspergillusoryzae)，命名為米曲霉 ZW2-1 (Aspergillus oryzae ZW2-1)，該菌株已于 2014 年 11 月 13日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2014565，地址:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心。
[0006]本發(fā)明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZW2_l，生長溫度范圍寬，在25-38°C范圍內均生長良好，生長快。其中，30°C條件下產酶活性最高。
[0007]本發(fā)明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) ZW2-1，其形態(tài)學特征如下:
[0008]在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上:菌株ZW2-1生長較快，280C 7天直徑可達76_80mm，基本布滿整個平板，質地緊密呈絮狀，菌落中央最先出現(xiàn)白色，培養(yǎng)2d左右菌落中央開始產生孢子并逐漸向外蔓延，顏色初為橄欖綠色，后逐漸呈黃綠色至綠色，無滲出液，菌落反面呈淺乳黃色(圖1)。真菌濕室培養(yǎng)后，在微分干涉顯微鏡下觀察該菌株自然狀態(tài)下的生長情況，結果表明該菌株菌絲發(fā)達、透明、有隔膜、足細胞，分生孢子頭初為球形，后呈輻射形，分生孢子梗有的生自基質，有的生于氣生菌絲，壁粗糙，頂囊呈球形，產孢結構單層，分生孢子球形(圖4)。
[0009]在察氏培養(yǎng)基上:菌株ZW2-1生長較緩慢，28°C 7天直徑可達50_60臟，質地絲絨狀，菌落層厚，菌落初期為白色，隨著菌落的生長，中心先形成黃綠色的孢子，后逐漸向外延伸，菌落生長緊密，具不規(guī)則的輻射狀條紋，無滲出液，菌落反面呈淡紅色(圖2)。
[0010]在察氏酵母膏培養(yǎng)基上:菌株ZW2-1生長與在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上相似，28°C 7天直徑可達80-84mm，可布滿整個平板，菌落層厚，中間向上凸起，質地絲絨狀，生長致密，孢子形成較慢，呈淡黃綠色，菌落反面淡粉紅色(圖3)。
[0011]本發(fā)明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) ZW2_1，其ITS序列由558個堿基(bp)組成，基因序列如下:
[0012]GGGCTACGAGCGTAGGATCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA
[0013]應用米曲霉菌株ZW2-1進行制曲、發(fā)酵，制得的種曲色澤鮮艷，孢子著生好，數量多，可達9*101(1個/g干基，結塊好，酶活力高且各組份活力平衡好，可有效地降解原料中的蛋白質和糖類，從而提高醬類制品的風味和品質；酪氨酸羧肽酶活性低，豆醬發(fā)酵過程中酪氨酸產生量低，可避免由于酪氨酸含量高而結晶析出產生“白點”。在保證產品品質的同時，可有效防止“白點”的廣生，對于提尚發(fā)酵調味品的質量和品質具有?米遠的意義。
[0014]本發(fā)明取得以下有益效果:
[0015]菌株(Aspergillus oryzae) ZW2-1生長溫度范圍寬，25_38°C范圍內均生長良好；不產黃曲霉毒素，安全無害；制曲過程中生長速度快，產孢豐富，可縮短生產周期，提高生產效益。制得的種曲色澤鮮綠，孢子著生好，結塊好，酶活力高且各組份活力平衡性好，可有效地降解原料中的蛋白質和糖類，酪氨酸羧肽酶活性低，可在保證產品品質的同時，有效防止“白點”的產生，從而提高醬類制品的風味和品質。將本發(fā)明提供的米曲霉菌株運用于醬類等發(fā)酵食品的生產中，對于降低生產成本、提高發(fā)酵調味品的質量和品質具有深遠的意義。
(四)【附圖說明】:
[0016]圖1為菌株ZW2-1在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖
[0017]圖2為菌株ZW2-1在察氏培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖
[0018]圖3為菌株ZW2-1在察氏酵母膏培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖
[0019]圖4為菌株ZW2-1在微分干涉顯微鏡下的分生孢子圖
[0020]圖5為菌株ZW2-1的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
(五)具體實施方案:
[0021]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明的實施和保護范圍不限于此。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，培養(yǎng)基定容均為水。
[0022]實施例1
[0023]米曲霉菌株(Aspergillusoryzae) Zff2-1 CCTCC N0.M 2014565 的分離、鑒定與保藏
[0024]—、米曲霉菌株的分離純化
[0025]1、材料準備
[0026]樣品來源:浙江五味和食品有限公司生產車間。
[0027]馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基:市購的馬鈴薯去皮后切成Icm2見方的小塊，稱取200g馬鈴薯塊，加5-6倍水，文火煮沸半個小時，用八層紗布過濾后，加蔗糖20g，瓊脂20g，定容至1000ml，121°C 滅菌 20min。
[0028]察氏培養(yǎng)基:蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1.0g, MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.0lg，酵母浸提物5g，瓊脂15-20g，定容至1000ml，121°C滅菌20min。
[0029]察氏酵母膏培養(yǎng)基:蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.0lg，瓊脂 15-20g，定容至 1000ml，121°C滅菌 20min。
[0030]小室培養(yǎng):取干熱滅菌的載玻片，在其上滴一小滴馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，再在培養(yǎng)基上蓋一個無菌蓋玻片，使蓋玻片與載玻片之間的距離剛好容納單層菌株生長；制好的載玻片培養(yǎng)基置于無菌的含有20 %甘油的平皿中，組成小室培養(yǎng)。
[0031]2、米曲霉菌株的分離
[0032]樣品取Ig到1ml無菌生理鹽水中，在渦旋振蕩器上把孢子充分分散在水中制成孢子懸液，然后依次取Iml孢子懸液到9ml無菌水中，經梯度稀釋，各個稀釋梯度的孢子懸液均用渦旋振蕩器分散均勻，各取200 μ I孢子懸液涂布于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，每個稀釋度做兩個平行，28°C條件下恒溫培養(yǎng)3天左右，得到不同的菌落。
[0033]挑取形態(tài)不同的菌落點接于馬