一種高產(chǎn)蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株及培育方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及到一種高產(chǎn)蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株，為一種新的菌株品種，本發(fā)明還提供 了該菌株的培育方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】： 蝙蝠蛾擬青霉為天然冬蟲夏草中分離到的內(nèi)寄生菌，是天然冬蟲夏草中普遍存在的一 種蟲草的無(wú)性型，該菌經(jīng)深層發(fā)酵所得的菌絲體與天然冬蟲夏草化學(xué)成分對(duì)比研宄表明， 兩者主要成分、藥理作用基本相似，為天然冬蟲夏草有效成分和功效的替代品。另外，該菌 已經(jīng)被列入"可用于保健品的真菌菌種名單"。蝙蝠蛾擬青霉菌絲體以其經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、品質(zhì)優(yōu) 良、使用方便開啟了蟲草應(yīng)用的新局面。
[0003]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的是提供一株蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株，為一種新的菌株，其菌絲體干重及 有效成分腺苷、多糖和蟲草酸的產(chǎn)量和原始菌株相比具有顯著提高。
[0004] 本發(fā)明公開的蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株，命名為：蝙蝠蛾擬青霉PH4tl (命名為： cAe/7 PH40)，該誘變菌株已于2014年12月26日保藏《中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心》，保藏號(hào)為：CCTCC NO :M 2014670,根據(jù)真菌的系統(tǒng)分類學(xué)和鑒定的進(jìn)化樹 表明，菌株屬于蝙蝠蛾擬青霉。
[0005] 本發(fā)明所述的蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株，其有以下方法誘變選育而制得，以蝙蝠蛾 擬青霉(購(gòu)買自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物保存中心RCEF1429)為出發(fā)菌株，采用化學(xué)誘變處理技 術(shù)，選育出高產(chǎn)的蝙蝠蛾擬青霉高產(chǎn)突變菌株P(guān)H 4(i。
[0006] 本發(fā)明所述的蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株的特征為：菌絲體干重、腺苷、甘露醇及多 糖的含量均有明顯提高，其中菌絲體干重較原出發(fā)菌株提高了 44.06 %，腺苷含量提高了 3. 59%，甘露醇含量提高了 104. 7%，多糖含量提高了 139.83%。
[0007] 采用本發(fā)明所述蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株進(jìn)行液體深層發(fā)酵的方法，包括以下步驟 完成： (1) 一級(jí)斜面菌種： 斜面培養(yǎng)基：土豆 200 g/L，葡萄糖 18-22 g/L，KH2PO4 0. 1-0. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 0· 1-0. 5 g/L，瓊脂 18-25 g/L。
[0008] 斜面菌種培養(yǎng)溫度26 ± I °C，4-5天菌絲長(zhǎng)滿斜面，放冰箱（2-4°C )保存?zhèn)溆谩?br>[0009] (2)二級(jí)搖瓶菌種 種子培養(yǎng)基：葡萄糖18-22 g/L，蛋白胨8-12 g/L，酵母浸粉8-12 g/L，KH2PO4 0.1-0. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 0· 1-0. 5 g/L，維生素 B1 0· 05-0.1 g/L。
[0010] 種子培養(yǎng)方法：將斜面母種接入液體種子培養(yǎng)基，在26±1°C，120-160 r/min的 搖床培養(yǎng)4d。
[0011] (3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液按5%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基(蔗糖：26-32 g/L，酵母浸粉：15-20g/L，蛋 白胨：8-12g/L，（NH4)2S04:8-12 g/L，KH2P04:2-4 g/L，MgS04:2-4 8/1，￥81:0.1-0.38/1，氯 化鋅：0. 01-0. 02g/L)中進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為250mL的搖瓶裝100mL，培養(yǎng)溫 度26°C，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)4d后收獲菌絲體。
[0012] (4) 100L發(fā)酵罐放大培養(yǎng) 將種子液按5 %接種量接入60L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于100L發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層 發(fā)酵培養(yǎng)，26°C，200 r/min，通氣量4 L/min，初始pH為5. 0,培養(yǎng)72 h。
[0013] 本發(fā)明的積極效果在于：提供了的蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株（PH4tl)為一種新菌株， 菌絲體干重、腺苷、甘露醇及多糖的含量均有明顯提高，其中菌絲體干重較原出發(fā)菌株提高 了 44. 06 %，腺苷含量提高了 3. 59%，甘露醇含量提高了 104. 7%，多糖含量提高了 139. 83%。 該蝙蝠蛾擬青霉誘變株P(guān)H4tl菌絲生長(zhǎng)快速，菌絲體初期為棕色，后期逐漸變?yōu)樽攸S色，可進(jìn) 行快速液體深層培養(yǎng)。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1 蝙蝠蛾擬青霉PH4tl的誘變選育方法 本發(fā)明所述的蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株的誘變方法為亞硝基胍誘變。
[0015] 1)將蝙蝠蛾擬青霉菌株，劃線接種于斜面培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，菌絲 體為白色，向斜面中注入無(wú)菌生理鹽水，震蕩后，采用9層紗布過濾，稀釋至濃度為IO 6個(gè)/ ml的孢子懸液，采用10ug/ml的無(wú)菌亞硝基胍溶液處理30min后，取孢子懸液采用無(wú)菌生理 鹽水逐級(jí)稀釋，涂布至種子培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)7天后，挑去單菌落于96孔板中保存。
[0016] 2)采用無(wú)菌接種針逐個(gè)挑去誘變菌株至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，于26°C恒溫?fù)u床 中150rpm培養(yǎng)5天，測(cè)定菌絲體干重、腺苷、多糖和蟲草酸含量，以篩選高產(chǎn)突變株。采用 HPLC法測(cè)定菌絲體中腺苷含量；采用蒽銅一硫酸法測(cè)定總糖含量；采用DNS方法測(cè)定單糖 含量；利用分光光度法測(cè)定蟲草酸含量。
[0017] 所述的蝙蝠蛾擬青霉誘變菌株，命名為：蝙蝠蛾擬青霉PH40 (paecilomyces hepiali chen&dai，PH4(I)，該誘變菌株已于2014年12月26日保藏《中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心》，保藏號(hào)為：CCTCC M 2014670,根據(jù)真菌的系統(tǒng)分類學(xué)和鑒定的進(jìn)化樹表明，菌株屬 于蝙蝠蛾擬青霉。
[0018] 實(shí)施例2 蝙蝠蛾擬青霉誘變株（PH4tl)與出發(fā)菌株比較及遺傳穩(wěn)定性考察 1)將原始菌株與誘變菌株P(guān)H4tl分別接種于種子培養(yǎng)基(蔗糖：26-32 g/L，酵母浸粉： 15-20g/L，蛋白胨：8-12g/L，（NH4)2S0 4:8-12 g/L，KH2P04:2-4 g/L，MgSO 4:2-4 g/L，VB1: 0· l-0.3g/L，氯化鋅：0.01-0.02g/L)中，于26°C，150rpm，培養(yǎng)4d進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，蝙蝠蛾 擬青霉誘變菌株菌絲體干重、腺苷、甘露醇及多糖的含量均有明顯提高，其中，菌體體干重 達(dá)14. 40 g/L，較原出發(fā)菌株提高了 44. 06 % ;腺苷含量可達(dá)0. 1038g/l，較原出發(fā)菌提高了 3. 59%;蟲草酸含量可達(dá)1.275 g/L，較原始菌株提高了 104. 7%;多糖含量可達(dá)1.364 g/L， 較原出發(fā)菌提高了 139.83%。
[0019] 表1原出發(fā)菌株與誘變菌株P(guān)H4tl有效成分含量比較
2)為了研宄誘變菌株的高生產(chǎn)性能遺傳特性是否穩(wěn)定，采用群體傳代的方法考察 了誘