細(xì)胞培養(yǎng)方法、細(xì)胞培養(yǎng)部件以及細(xì)胞培養(yǎng)裝置的制造方法
【專利說明】細(xì)胞培養(yǎng)方法、細(xì)胞培養(yǎng)部件以及細(xì)胞培養(yǎng)裝置 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)方法、細(xì)胞培養(yǎng)部件以及細(xì)胞培養(yǎng)裝置。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 為了獲得源自單一細(xì)胞具有相同遺傳信息的細(xì)胞集團（以下有時稱為"克隆細(xì) 胞"），需要在與其他細(xì)胞的接觸等得到了抑制的單一地播種的狀態(tài)下對單一細(xì)胞進行培 養(yǎng)。據(jù)預(yù)測，此種獲得克隆細(xì)胞的方法在工業(yè)利用多能性細(xì)胞的情況下是特別有需求的。
[0003] 作為用于獲得克隆細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法，例如國際公開第13/058403號公報中公 開了一種在培養(yǎng)液的層流條件得到了調(diào)整的微流路內(nèi)對經(jīng)單一分散的細(xì)胞進行培養(yǎng)的方 法。
[0004] 此外，國際公開第11/043405號公報中公開了一項發(fā)明，其是以單一細(xì)胞的狀態(tài) 且保持分化多能性的狀態(tài)下對經(jīng)單一分散的人多能性干細(xì)胞進行培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，應(yīng) 用的培養(yǎng)基材的細(xì)胞外底物的涂層是人層粘連蛋白α5Μγ1的E8片段或人層粘連蛋白 α 3β 3γ2的Ε8片段。
[0005] 另一方面，國際公開第09/123349號公報中公開了一種培養(yǎng)方法，其目的是在維 持多能性干細(xì)胞的分化多能性的同時避免病毒混入等潛在的危險性，該方法中，在含有層 粘連蛋白5且不含有支持細(xì)胞或血清的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0006] 【現(xiàn)有技術(shù)文獻】
[0007] 【專利文獻】
[0008] 專利文獻1 :國際公開第13/058403號公報
[0009] 專利文獻2 :國際公開第11/043405號公報
[0010] 專利文獻3 :國際公開第09/123349號公報 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0011]【發(fā)明所要解決的課題】
[0012] 如上所述，國際公開第13/058403號公報和國際公開第11/043405號公報中記載 了通過培養(yǎng)得到克隆細(xì)胞的內(nèi)容。
[0013] 上述國際公開第13/058403號公報的技術(shù)基于的認(rèn)識是通過在層流條件輸送培 養(yǎng)基能夠基于單分散培養(yǎng)克隆化。
[0014] 另外，對于上述國際公開第11/043405號公報的技術(shù)，由于是在底面積小的孔板 上將單一分散的細(xì)胞播種I X IO3個~5 X 10 4個，因此可能在播種后細(xì)胞彼此發(fā)生粘接，僅 形成2個以上細(xì)胞的狀態(tài)的才進行增殖。
[0015] 需要說明的是，作為單一細(xì)胞的培養(yǎng)方法，也可以考慮使用通過切斷細(xì)胞間的粘 接而抑制凋亡的被稱作凋亡抑制劑（Rock inhibitor)的藥劑的方法，但由于擔(dān)心藥劑等的 添加會對細(xì)胞品質(zhì)造成不良影響，因此不優(yōu)選。
[0016] 本發(fā)明的目的在于提供能夠以單一的狀態(tài)培養(yǎng)單一細(xì)胞并獲得其克隆細(xì)胞的細(xì) 胞培養(yǎng)方法、細(xì)胞培養(yǎng)部件以及細(xì)胞培養(yǎng)裝置。
[0017] 【解決課題的手段】
[0018] 本發(fā)明如下所述。
[0019] [1] -種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其具備以下工序：播種工序，在于內(nèi)壁上具有涂層的微流 路的所述涂層上單獨地播種單一細(xì)胞，所述涂層包含層粘連蛋白；和循環(huán)工序，使培養(yǎng)液循 環(huán)于在所述播種工序中單獨地播種有單一細(xì)胞的所述微流路內(nèi)。
[0020] [2]如[1]所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，所述播種工序中，經(jīng)播種的單一細(xì)胞是利 用包含層粘連蛋白的培養(yǎng)基經(jīng)傳代培養(yǎng)得到的。
[0021] [3]如[2]所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，所述傳代培養(yǎng)的次數(shù)為2次以上。
[0022] [4]如[1]~[3]的任意1項所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，所述培養(yǎng)液為馴化培養(yǎng) 液。
[0023] [5]如[1]~[4]的任意1項所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，所述循環(huán)工序中，對于 在所述播種工序中單獨地播種有單一細(xì)胞的所述微流路內(nèi)，在維持充滿所述培養(yǎng)液的狀態(tài) 后，開始所述培養(yǎng)液的循環(huán)。
[0024] [6]如[1]~[5]的任意1項所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，所述層粘連蛋白為人層 粘連蛋白。
[0025] [7]如[1]~[6]的任意1項所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，所述微流路內(nèi)具有將單 一細(xì)胞與其他細(xì)胞隔離的隔離結(jié)構(gòu)。
[0026] [8] -種細(xì)胞培養(yǎng)部件，其包括微流路，所述微流路在用于播種單一細(xì)胞的內(nèi)壁上 具有包含層粘連蛋白的涂層。
[0027] [9]如[8]所述的細(xì)胞培養(yǎng)部件，其中，所述微流路內(nèi)具有將單一細(xì)胞與其他細(xì)胞 隔離的隔離結(jié)構(gòu)。
[0028] [10] -種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其具備：[8]或[9]所述的細(xì)胞培養(yǎng)部件、和使培養(yǎng)液在 所述細(xì)胞培養(yǎng)部件的所述微流路內(nèi)循環(huán)的循環(huán)裝置。
[0029] 【發(fā)明的效果】
[0030] 本發(fā)明能提供能夠以單一的狀態(tài)培養(yǎng)單一細(xì)胞并獲得其克隆細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方 法、細(xì)胞培養(yǎng)部件以及細(xì)胞培養(yǎng)裝置。 【【附圖說明】】
[0031] 圖1是顯示本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的整體構(gòu)成的一例的俯視圖。
[0032] 圖2是顯示本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)部件的一例的分解立體圖。
[0033] 圖3是顯示本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)部件的一例的截面圖。
[0034] 圖4是顯示本發(fā)明的其他的細(xì)胞培養(yǎng)部件的一例的截面圖。
[0035] 圖5是顯示本發(fā)明的其他的細(xì)胞培養(yǎng)部件的一例的截面圖。
[0036] 圖6是顯示利用相位差顯微鏡對通過本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法的一例培養(yǎng)出的細(xì) 胞進行觀察的結(jié)果的圖。
[0037] 圖7A是顯示對在微流路內(nèi)自培養(yǎng)起第14天的TIGl-iPSC進行觀察的結(jié)果的圖。
[0038] 圖7B是顯示將圖7A的TIGl-iPSC取出在包覆有基質(zhì)膠（matrigel)的微板上進 行馴化培養(yǎng)并對培養(yǎng)后的TIGl-iPSC進行觀察的結(jié)果的圖。
[0039] 圖7C是顯示將圖7B的TIGl-iPSC取出進而進行第1次傳代培養(yǎng)并對培養(yǎng)后的 TIGl-iPSC進行觀察的結(jié)果的圖。
[0040] 圖8是顯示利用免疫染色法對通過本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法的一例培養(yǎng)出的細(xì)胞 維持了多能性進行確認(rèn)的結(jié)果的圖。 【【具體實施方式】】
[0041] [細(xì)胞培養(yǎng)方法]
[0042] 本發(fā)明的一個方面是一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其具備以下工序：播種工序，微流路在 內(nèi)壁上具有用于播種單一細(xì)胞的包含層粘連蛋白的涂層，在所述涂層上單獨地播種單一細(xì) 胞；和循環(huán)工序，使培養(yǎng)液循環(huán)于在所述播種工序中單獨地播種有單一細(xì)胞的所述微流路 內(nèi)。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法，通過經(jīng)由播種工序和循環(huán)工序，能夠以單一的狀態(tài) 培養(yǎng)單一細(xì)胞，獲得其克隆細(xì)胞。
[0044] 以下對各工序進行說明。
[0045] (播種工序）
[0046] 播種工序中，在于內(nèi)壁上具有包含層粘連蛋白的涂層的微流路的涂層上單獨地播 種單一細(xì)胞。
[0047] 此處，"單一細(xì)胞"是指不與其他細(xì)胞接觸的細(xì)胞，2個以上的細(xì)胞未不借助鈣黏蛋 白等細(xì)胞外基體接合，具體表示分離開的單個細(xì)胞。
[0048] 并且，所謂"以單一的狀態(tài)播種單一細(xì)胞"或"單獨地播種單一細(xì)胞"表示，在不與 其他細(xì)胞接觸、且難以與其他細(xì)胞接觸的狀態(tài)下播種單一細(xì)胞。
[0049] 作為以單一的狀態(tài)播種單一細(xì)胞的方法，可以舉出例如在具有涂層的微流路（以 下有時僅稱為"微流路"）中注入分散為單一細(xì)胞的單一細(xì)胞分散液并使其流動的方法。
[0050] 具體地說，可以舉出（1)將單一細(xì)胞的濃度低的單一細(xì)胞分散液注入微流路的方 法；（2)將單一細(xì)胞的濃度低的單一細(xì)胞分散液注入具有將單一細(xì)胞與其他細(xì)胞隔離的隔 離結(jié)構(gòu)的微流路內(nèi)的方法。
[0051] 針對隔離結(jié)構(gòu)的詳細(xì)情況將在細(xì)胞培養(yǎng)部件的項中進行說明。
[0052] 對于以單一的狀態(tài)播種的單一細(xì)胞彼此的間隔，從以單一的狀態(tài)播種的方面考 慮，優(yōu)選為1mm以上的間隔，更優(yōu)選為1mm以上IOmm以下的間隔。
[0053] 單一細(xì)胞分散液包含單一細(xì)胞、溶劑和其他的添加劑。
[0054] 作為溶劑，可以舉出例如培養(yǎng)液。但是，培養(yǎng)液優(yōu)選與后述的循環(huán)工序中進行循環(huán) 的培養(yǎng)液相同。
[0055] 對于單一細(xì)胞分散液中細(xì)胞的濃度，從以單一的狀態(tài)播種單一細(xì)胞的方面考慮， 優(yōu)選低濃度。
[0056] 具體地說，單一細(xì)胞分散液中細(xì)胞的濃度優(yōu)選為例如2.5X102細(xì)胞/ml以上 1.0 X IO4細(xì)胞/ml以下，更優(yōu)選為5. OX 10 2細(xì)胞/ml以上5. OX 10 3細(xì)胞/ml以下，特別優(yōu) 選為5. OX IO2細(xì)胞/ml。
[0057] 播種的單一細(xì)胞彼此的間隔可以通過單一細(xì)胞分散液的細(xì)胞濃度來調(diào)整。
[0058] 作為單一細(xì)胞分散液的制備方法、即獲得單一細(xì)胞的方法，例如，作為從通過鈣黏 蛋白等接合在一起的2個以上的細(xì)胞組中分離出1個細(xì)胞的方法可以舉出公知的方法，可 以舉出例如力學(xué)的方法、使用藥劑獲得的方法。
[0059] 作為藥劑，可以舉出具有蛋白酶活性的酶或含有EDTA(乙二胺四乙酸）的試劑， 作為試劑，具體可以舉出例如胰島素/EDTA、Accutase (注冊商標(biāo)、Bioneer社制造）、和 Accumax (注冊商標(biāo)、Bioneer社制造），但不限于這些。
[0060] 需要說明的是，針對利用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞將后述。
[0061] 單獨地播種單一細(xì)胞的涂層中含有層粘連蛋白。
[0062] 層粘連蛋白是作為基底膜的主要構(gòu)成成分的公知的糖蛋白質(zhì)，只要是被鑒定為層 粘連蛋白的物質(zhì)就可以使用。并且，層粘連蛋白也不必經(jīng)精制，也可以使用含有層粘連蛋白 作為主要構(gòu)成成分的基底膜提取物等。
[0063] 并且，層粘連蛋白可以使用例如人來源、小鼠來源、大鼠來源等任一種，其中優(yōu)選 人來源的人層粘連蛋白。
[0064] 作為人層粘連蛋白，可以舉出人層粘連蛋白521、人層粘連蛋白511、人層粘連蛋 白522、人層粘連蛋白523,其中優(yōu)選人層粘連蛋白521、人層粘連蛋白511，特別優(yōu)選人層粘 連蛋白521。
[0065] 針對涂層的詳細(xì)內(nèi)容將后述。
[0066] 以單一狀態(tài)播種的單一細(xì)胞優(yōu)選為從利用包含層粘連蛋白的培養(yǎng)基經(jīng)傳代培養(yǎng) 的細(xì)胞中得到的細(xì)胞。
[0067] 即，對于以單一狀態(tài)播種的單一細(xì)胞來說，相對于利用包含層粘連蛋白的培養(yǎng)基 培養(yǎng)的細(xì)胞組，優(yōu)選通過上述的制備單一細(xì)胞分散液的方法分離得到的單一細(xì)胞。
[0068] 作為層粘連蛋白，可以舉出例如與單獨地播種單一細(xì)胞涂層所含有的層粘連蛋白 相同種類的層粘連蛋白。
[0069] 需要說明的是，優(yōu)選傳代培養(yǎng)用的培養(yǎng)基所含有的層粘連蛋白與微流路的涂層的 層粘連蛋白為相同種類。
[0070] 作為用于傳代培養(yǎng)的包含層粘連蛋白的培養(yǎng)基，可以舉出例如至少表面存在層粘 連蛋白分子的固相上的培養(yǎng)基，具體地可以舉出例如包覆有層粘連蛋白的微板。包覆有層 粘連蛋白的微板以動物細(xì)胞培養(yǎng)用微板的形式有市售，因此本發(fā)明的方法中可以優(yōu)選使用 這些市售的層粘連蛋白包覆微板。
[0071] 利用包含層粘連蛋白的培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)的次數(shù)越多越優(yōu)選，特別優(yōu)選為2次 以上。
[0072] 即，對于以單一狀態(tài)播種的單一細(xì)胞來說，相對于利用包含層粘連蛋白的培養(yǎng)基 連續(xù)傳代培養(yǎng)至少2次以上的細(xì)胞組，優(yōu)選通過上述的制備單一細(xì)胞分散液的方法分離得 到的單一細(xì)胞。
[0073] 利用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞主要為多能性細(xì)胞，但不限于此，也可以 為其他細(xì)胞。
[0074] 此處，本發(fā)明中使用的"多能性細(xì)胞"是指具有分化為2種以上細(xì)胞的能力的細(xì) 胞。例如，多能性細(xì)胞包括㈧胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）、⑶精子干細(xì)胞（GS細(xì)胞）、（C)胚 胎生殖細(xì)胞（EG細(xì)胞）、（D)人工多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）、（E)通過核移植得到的克隆胚來 源的ES細(xì)胞、和（F)培養(yǎng)纖維原細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞來源的多能性細(xì)胞（多系分化持續(xù)應(yīng)激 細(xì)胞，Muse細(xì)胞），但不限于這些。多能性細(xì)胞可以來源于各種生物。優(yōu)選的是來源于包括 人的哺乳類動物的多能性細(xì)胞，更優(yōu)選來源于小鼠的多能性細(xì)胞或來源于靈長類的多能性 細(xì)胞。特別優(yōu)選的是來源于人的多能性細(xì)胞。
[0075] 以下針對⑷~（F)的細(xì)胞進行說明。
[0076] ㈧胚胎干細(xì)胞
[0077] ES細(xì)胞為由人或小鼠等哺乳動物的早期胚胎（例如胚泡）的內(nèi)部細(xì)胞團確立的、 具有多能性和基于自身復(fù)制的增殖能力的干細(xì)胞。