一株重組傳染性造血器官壞死病毒rIHNV HLJ-09株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株重組傳染性造血器官壞死病毒rIHNV HLJ-09株及其構(gòu)建方法和 應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳染性造血器官壞死（Infectious haematopoietic necrosis，IHN)是由彈狀病 毒科諾拉彈狀病毒屬的傳染性造血器官壞死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)感染鮭科魚類以造血器官出血、壞死為主要病理特征的一種高度傳染性和急 性病毒性疾病。IHNV是魚類彈狀病毒的典型代表，危害魚種類范圍很廣，有能力感染鮭魚科 的所有品種。IHNV高致病力毒株對鮭鱒稚魚的致死率高達100%，感染后幸存的魚終生帶 毒，成為潛在的傳染源，并通過糞便和精卵排出病原。目前此病廣泛流行于北美、歐洲、亞洲 的各國，已成為世界性鮭鱒魚病，隨著水生動物及其產(chǎn)品進出口貿(mào)易的急劇增加，IHN已經(jīng) 傳入我國，并在我國局部地區(qū)流行。給鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。IHNV只有一個血清 型。現(xiàn)今已確定IHNV有4個基因型：U基因型，M基因型，L基因型，JRt基因型。前三種基 因型主要在北美和歐洲流行，JRt基因型在亞洲日本和韓國爆發(fā)。IHNV是OIE公布要求上 報的7種鮭鱒病毒性疾病之一，也是口岸魚類的第一類檢疫對象。
[0003] 反向遺傳學(xué)是針對遺傳物質(zhì)為RNA的生物體而言，在獲得生物體基因組全部CDNA 序列的基礎(chǔ)上，通過對靶基因進行必要的加工和修飾，再按基因組組成順序構(gòu)建含有生物 體必需元件的修飾基因組，讓其裝配出具有生命活性的個體，研宄基因組結(jié)構(gòu)與功能，以及 這些修飾可能對生物體的表型、性狀的影響等方面的內(nèi)容。RNA病毒的反向遺傳操作，即構(gòu) 建RNA病毒的DNA副本，并在DNA水平對病毒基因組進行定向修飾，模擬真實病毒粒子的生 命周期，用以研宄病毒基因結(jié)構(gòu)與功能、病毒與宿主之間相互作用的關(guān)系等。RNA病毒突變 率較高，直接對其進行定向操作比較困難?；贒NA水平的反向遺傳操作為研宄RNA病毒 的復(fù)制及調(diào)控機理、病毒毒力、病毒-宿主相互作用和研制新型基因工程疫苗等提供了重 要的技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一株重組傳染性造血器官壞死病毒rIHNV HLJ-09株。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0006] 重組傳染性造血器官壞死病毒rIHNV HLJ-09株的獲得：
[0007] 親本病毒HLJ-09毒株為2009年本實驗室從黑龍江省某虹鱒養(yǎng)殖場爆發(fā)急性疾病 的死亡的虹鱒組織分離的IHNV。HLJ-09株基因組共包含6種基因，分別編碼核衣殼蛋白 (N)，磷蛋白（P)，基質(zhì)蛋白（M)，糖蛋白（G)，非病毒結(jié)構(gòu)蛋白（NV)和病毒聚合酶（L)?；?組的順序為3'-N-P-M-G-NV-L-5'。根據(jù)測定的傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的全基 因序列（Genbank accession no. JX649101)，設(shè)計特異性引物，構(gòu)建兩端分別帶有錘頭狀核 酶（HamRz)和丁型肝炎核酶（HdvRz)全長基因組cDNA重組真核表達質(zhì)粒，以及核蛋白（N)、 磷酸化蛋白（P)、RNA依賴的RNA聚合酶蛋白（L)、非結(jié)構(gòu)蛋白（NV)四個參與病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù) 制的輔助質(zhì)粒，將上述5個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染EPC細胞，在細胞RNA聚合酶II的作用下啟動真核 表達載體PCI的CMV啟動子起始轉(zhuǎn)錄各個目的基因，拯救HLJ-09株重組傳染性造血器官壞 死病毒（rlHNV)，即為重組病毒rIHNV HLJ-09株。
[0008] 獲得的重組傳染性造血器官壞死病毒株，命名為rIHNV HLJ-09,分類命名為傳染 性造血器官壞死病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研宄所，微生物保藏號為CGMCC No. 8606,保藏日 期為2013年12月11日。
[0009] 進一步的，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建所述的病毒rIHNV HLJ-09株的方法，其特征在 于，采用反向遺傳操作系統(tǒng)拯救重組傳染性造血器官壞死病毒rIHNV HLJ-09株。
[0010] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，包括以下步驟：
[0011] ⑴根據(jù)傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的全基因序列，設(shè)計特異性引物，構(gòu) 建包括受控于真核啟動子的傳染性造血器官壞死病毒株HLJ-09的全基因組cDNA序列的轉(zhuǎn) 錄質(zhì)粒；
[0012] (2)根據(jù)傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的全基因序列，設(shè)計特異性引物，構(gòu) 建分別包括編碼所述傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的核蛋白（N)的cDNA序列、編碼 所述傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白（P)的cDNA序列、編碼所述傳染性 造血器官壞死病毒HLJ-09株的RNA依賴的RNA聚合酶蛋白（L)的cDNA序列以及編碼所述 傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的非結(jié)構(gòu)蛋白（NV)的cDNA序列的四個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒， 四個輔助質(zhì)粒均受控于真核啟動子；
[0013] (3)將上述的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染用于病毒拯救的宿主細胞，培養(yǎng) 轉(zhuǎn)染后的宿主細胞，從轉(zhuǎn)染細胞的上清液中拯救重組傳染性造血器官壞死病毒株rIHNV HLJ-09。
[0014] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述真核啟動子為CMV啟動子。
[0015] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（1)中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒還包括編碼錘頭狀核酶（HamRz)的 序列、編碼丁型肝炎核酶（HdvRz)的序列以及位于全基因組cDNA序列內(nèi)部的分子標(biāo)識，所 述全基因組cDNA序列位于真核啟動子和編碼錘頭狀核酶（HamRz)的序列之后，編碼丁型肝 炎核酶（HdvRz)之前，共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄模板。
[0016] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述分子標(biāo)識是位于全基因組cDNA序列內(nèi)部的SnaB I酶切 位點以及Spe I酶切位點。
[0017] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（1)中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒為pIHNV-HLJ-09 ;所述傳染性造血 器官壞死病毒株HLJ-09的全基因組cDNA序列從5'至3'方向依次分成Fl片段、F2片段、 F3片段、F4片段、F5片段和F6片段6個片段進行擴增，擴增Fl片段的引物的核苷酸序列 為SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示，擴增F2片段的引物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 3和 SEQ ID N0:4所示，擴增F3片段的引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示， 擴增F4片段的引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示，擴增F5片段的引 物的核苷酸序列為SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10所示，擴增F6片段的引物的核苷酸序列 為 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 所示。
[0018] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（2)中所述四個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是通過將編碼所述傳染 性造血器官壞死病毒HLJ-09株的核蛋白（N)的cDNA序列、編碼所述傳染性造血器官壞死 病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白（P)的cDNA序列、編碼所述傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09 株的RNA依賴的RNA聚合酶蛋白（L)的cDNA序列以及編碼所述傳染性造血器官壞死病 毒HLJ-09株的非結(jié)構(gòu)蛋白（NV)的cDNA序列分別克隆于載體pCI中得到的，分別命名為 pCI-N，pCI-P，pCI-L以及pCI-NV ;擴增所述傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的核蛋白 (N)的cDNA序列的引物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20所示；擴增所述傳 染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白（P)的的cDNA序列的引物的核苷酸序列為 SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22所示；擴增所述傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的RNA 依賴的RNA聚合酶蛋白（L)的cDNA序列的引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:23-26所示；擴 增所述傳染性造血器官壞死病毒HLJ-09株的非結(jié)構(gòu)蛋白（NV)的cDNA序列的引物的核苷 酸序列為SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:28所示。
[0019] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（3)中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和四個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒的濃度均為 1 μ g/mL，轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和四個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒的質(zhì)量比為：pIHNV-HLJ-09 :pCI-N :pCI-P :pCI-L : pCI-NV = 10:5:5:2:1 ;所述宿主細胞為EPC細胞。
[0020] 本發(fā)明中應(yīng)用rIHNV HLJ-09反向遺傳系統(tǒng)，將rIHNV HLJ-09的NV ORF用報告基 因 EGFP(綠色熒光蛋白）編碼基因替換，成功拯救病毒，重組病毒命名為rlHNV-EGFP。激光 共聚焦顯微鏡觀察該病毒侵染細胞可觀察到明顯的綠色熒光。說明該rIHNV HLJ-09可應(yīng) 用于表達外源蛋白。
[0021] 因此，進一步的，本發(fā)明還提供了所述的病毒rIHNV HLJ-09株在作為表達外源蛋 白病毒載體中的應(yīng)用。
[0022] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，利用反向遺傳技術(shù)在rIHNV HLJ-09病毒基因組內(nèi)插入外源 基因，表達外源基因蛋白。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0024] 本發(fā)明利用采用反向遺傳操作系統(tǒng)拯救重組傳染性造血器官壞死病毒rIHNV HLJ-09株。拯救的病毒具有特征性的分子標(biāo)識，通過感染重組病毒的細胞傳代實驗證明此 病毒能夠穩(wěn)定傳代。重組病毒rIHNV HLJ-09腹腔接種虹鱒幼魚，結(jié)果導(dǎo)致幼魚發(fā)病死亡， 致死率可達90%，表明此病毒具有與親代HLJ-09株病毒相似的致病特性。進一步，本發(fā)明 中利用rIHNV HLJ-09反向遺傳系統(tǒng)，將rIHNV HLJ-09的NV ORF用報告基因 EGFP (綠色熒 光蛋白）編碼基因替換，成功拯救病毒，拯救病毒命名為rlHNV-EGFP。激光共聚焦顯微鏡觀 察rlHNV-EGFP病毒侵染的細胞可觀察到明顯的綠色熒光，說明該rIHNV HLJ-09病毒株可 應(yīng)用于表達外源蛋白。
【附圖說明】
[0025] 圖 1 為全長 cDNA 的 Fl 段-F6 段 PCR產(chǎn)物圖，其中，M 為 DL DNA 2000Marker，F(xiàn)l-F6 為F1-F6段PCR產(chǎn)物；
[0026] 圖2為口(：1-1圓￥-!^1-09酶切鑒定結(jié)果圖，其中，]\1為01^150000嫩1&^1?51'，1為他6 I單酶切