類芽孢桿菌CGMCC No.8333凝乳酶及制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種類芽孢桿菌CGMCC No. 8333凝乳酶及制 備方法。
【背景技術】
[0002] 與植物來源和動物來源的凝乳酶相比較，微生物來源的凝乳酶具有生產成本低、 生化多樣性高、基因易改造的優(yōu)勢。目前，越來越多的報道說明微生物的胞外蛋白酶具有凝 乳功能，部分微生物的凝乳酶已實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產，并廣泛應用于干酪生產中。能夠產 生具有一定凝乳作用的胞外蛋白酶的微生物主要屬于放線菌、細菌和霉菌等的范疇，包括 放線菌中的鏈霉菌屬、小單孢菌屬、馬杜拉放線菌屬，霉菌中根霉、總狀毛霉、微小毛霉、米 黑毛霉、易脆毛霉，細菌中粟疫菌、寄生內座殼菌以及其他通過基因工程或輻照獲得的高產 凝乳酶的菌株等。
[0003] 將凝乳酶從發(fā)酵上清中分離出來并實現(xiàn)凝乳酶的高效回收是分離純化、酶學性質 研宄以及工業(yè)化生產凝乳酶的前提和基礎。常用的分離方法有鹽析法、有機溶劑沉淀法 (乙醇、丙酮）以及等電點法，其中，鹽析、乙醇和丙酮沉淀應用最為廣泛。例如，有學者使 用1%氯化鈉溶液浸提微小毛霉發(fā)酵液中的凝乳酶，后用95%的乙醇對浸提物進行沉淀； 有學者使用乙醇按不同比例分步提取微小毛霉發(fā)酵液中的凝乳酶；還有學者以總狀毛霉 R132的發(fā)酵液為研宄對象，對其超濾后進行乙醇分步提取。另有其他學者利用丙酮、乙醇等 對栗疫菌、根霉、青霉、曲霉、枯草芽孢桿菌、粘球菌、糞腸球菌產凝乳酶進行初步分離提取。
[0004] 中國專利申請（CN103740618A)公開了類芽孢桿菌屬的一個新菌種類芽孢桿 菌 BD3526，Paenibacillus damxungensis sp. ηον·，并將其于 2013 年 10 月 14 日保藏在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，該菌株的保藏編號為：CGMCC No. 8333。該菌株的菌落非常粘稠，表明該菌株具有高產胞外多糖的生理特性。中國專利申 請（CN104450655A)公開了使用乙醇提取類芽孢桿菌BD3526麩皮發(fā)酵液上清中凝乳酶，但 是其操作工藝復雜，所得凝乳酶的回收率低，難以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產的需要。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對目前利用類芽孢桿菌麩皮發(fā)酵物制備凝乳酶 時，所得的發(fā)酵物粘稠難以將凝乳酶純化分離，所得的凝乳酶回收率低，難以滿足大規(guī)模工 業(yè)化生產的需要的不足，提供一種利用類芽孢桿菌麩皮發(fā)酵物制備凝乳酶的方法。所述的 方法達到了凝乳酶回收率高和粗酶樣品中多糖含量較低的良好效果。
[0006] 本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌CGMCC No. 8333具有高產凝乳酶的特性外，還具有 很強的胞外多糖的合成能力，發(fā)酵液中的多糖具有強的懸浮性能，不能實現(xiàn)凝乳酶和胞外 多糖的有效分離。利用乙醇沉淀時，凝乳酶回收率雖高，但混雜了很多的胞外多糖，溶解性 能差、黏度很高，限制了后期分離純化和酶學性質研宄，在工業(yè)化生產上也不具備可行性， 因此本發(fā)明人對類芽孢桿菌CGMCC No. 8333發(fā)酵液分離純化凝乳酶的工藝進行調整改進。
[0007] 本發(fā)明提供一種利用類芽抱桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov. )CGMCC No. 8333發(fā)酵液制備凝乳酶的方法，其包括以下的步驟：
[0008] (1)將保藏編號為CGMCC No. 8333的類芽孢桿菌的發(fā)酵液離心得發(fā)酵上清液；
[0009] (2)將步驟（1)所得發(fā)酵上清液與硫酸銨混合得混合液，所述混合液中硫酸銨的 飽和度為50~75%，2~6°C靜置混合液0~5h，離心收集沉淀物；
[0010] ⑶將步驟⑵所得沉淀物溶解，離心，取上清液，即得凝乳酶。
[0011] 步驟（1)為：將保藏編號為CGMCC No. 8333的類芽孢桿菌的發(fā)酵液離心得發(fā)酵上 清液。其中，較佳地，發(fā)酵液是由包括以下的步驟制備而得的：將保藏編號為CGMCC No. 8333 的類芽孢桿菌的種子液接種于麩皮培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)得發(fā)酵液。所述的麩皮培養(yǎng)基為本領域 常規(guī)的麩皮培養(yǎng)基，其包括麩皮和水。所述的麩皮為本領域常規(guī)的麩皮，較佳地為小麥麩 皮。所述麩皮的含量為本領域常規(guī)的含量，較佳地為1 %~5 %，更佳地為2 %，所述百分比 為質量百分比。較佳地，所述發(fā)酵培養(yǎng)在錐形瓶中進行，更佳地在250mL錐形瓶中進行。所 述錐形瓶中所述的麩皮培養(yǎng)基的裝液量為本領域常規(guī)裝液量，更佳地為50mL。所述發(fā)酵培 養(yǎng)的時間為本領域常規(guī)的時間，較佳地為48~72小時。所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為本領域常 規(guī)的溫度，較佳地為28~30°C。所述的種子液的接種量為本領域常規(guī)的接種量，較佳地為 2~4%，所述百分比為體積百分比。所述發(fā)酵培養(yǎng)的方式為本領域常規(guī)的方式，較佳地為 震蕩培養(yǎng)。所述震蕩培養(yǎng)的速度為本領域常規(guī)的速度，較佳地為180~300r/min。
[0012] 較佳地，所述的種子液是由包括以下的步驟制備而得的：將保藏編號為CGMCC No. 8333的類芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)得種子液。所述的種子培養(yǎng)基為本領域 常規(guī)的種子培養(yǎng)基，較佳地為TYC培養(yǎng)基。所述的TYC培養(yǎng)基為常規(guī)的TYC培養(yǎng)基，較佳的 由以下組分組成：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5. 0g/L，L-胱氨酸0. 2g/ L，乙酸鈉 20g/L，Na2SO4 0· lg/L，NaCl lg/L，Na2HPO4 · 12H20 2g/L，NaHCO3 2g/L，瓊脂 15 ~ 20g/L，余量為水。所述種子培養(yǎng)的時間為本領域常規(guī)的時間，較佳地為20小時。所述種子 培養(yǎng)的溫度為本領域常規(guī)的溫度，較佳地為28~30°C。所述離心的時間為本領域常規(guī)的時 間，較佳地為15min。所述離心的溫度為本領域常規(guī)的溫度，較佳地為4°C。所述離心的速 度為本領域常規(guī)的速度，較佳地為15000g。
[0013] 步驟（2)為：將步驟（1)所得發(fā)酵上清液與硫酸銨混合得混合液，所述混合液中硫 酸銨的飽和度為50~75 %，2~6 °C靜置混合液0~5小時，離心收集沉淀物。其中，較佳 地，所述混合液中硫酸銨的飽和度為50~60%，更佳地為60%。所述靜置的時間為0~5 小時，較佳地為2小時。所述靜置的溫度為2~6°C，較佳地為2~4°C。所述離心的時間 為本領域常規(guī)的時間，較佳地為15分鐘。所述離心的溫度為本領域常規(guī)的溫度，較佳地為 4°C。所述離心完成后，初步獲得了凝乳酶含量較高的粗提物。 _4] 步驟⑶為：將步驟⑵所得沉淀物溶解，離心，取上清液，即得凝乳酶。其中，所 述溶解的溶劑為本領域常規(guī)的溶劑，較佳地為水或PBS溶液。所述的PBS溶液為本領域常 規(guī)的PBS溶液，較佳地為0. 02mol/L、pH 7. 0的PBS溶液。所述離心的時間為本領域常規(guī)的 時間，較佳地為15分鐘。所述離心的溫度為本領域常規(guī)的溫度，較佳地為4°C。所述離心的 速度為本領域常規(guī)的速度，較佳地為15000g。所述離心的步驟回收率殘留在凝乳酶中不溶 解的雜質，如菌體、培養(yǎng)基和其他的代謝產物等。較佳地，步驟（3)還包括將步驟（3)所述 上清液凍干的步驟。所述的凍干為本領域常規(guī)的凍干，能夠將上清液冷凍干燥即可。
[0015] 本發(fā)明提供一種由上述的方法制備獲得的凝乳酶。
[0016] 所述的凝乳酶具有較高的酶活性，凝乳酶活回收率高達21. 86%，適用于工業(yè)化應 用生產。
[0017] 本發(fā)明所述的類芽孢桿菌CGMCC No. 8333從西藏當雄縣采集的牦牛乳樣品中分離 獲得，但不僅限于所述的來源。本發(fā)明所用的類芽孢桿菌已保藏在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心（CGMCC)，其保藏號為：CGMCC No. 8333,命名為BD3526。并且其在 中國專利申請CN103740618A中公開，該專利申請的全文為本發(fā)明所引用。
[0018] 本發(fā)明的一較佳的實施例是，將類芽孢桿菌BD3526接種于TYC培養(yǎng)基（酪蛋白胨 15g/L，蔗糖 50g/L，酵母膏 5. Og/L，L-胱氨酸 0· 2g/L，乙酸鈉 20g/L，Na2SO4 0· lg/L，NaCl lg/L，Na2HPO4 · 12H20 2g/L，NaHCO3 2g/L，瓊脂 15g/L，余量為水）中 30°C種子培養(yǎng) 20 小時 獲得種子液，將4% (v/v)種子液接種于含有50mL麩皮培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30°C、搖 床震蕩速度180r/min發(fā)酵培養(yǎng)72小時得BD3526發(fā)酵液。所述麩皮培養(yǎng)基的中，小麥麩皮 的質量百分含量為2%，余量為水。將BD3526發(fā)酵液于4°C、15000g條件下離心15分鐘后 收集發(fā)酵上清液，使用〇. 〇2mol/L、pH7. 0的PBS溶液將發(fā)酵上清液稀釋3倍，將硫酸銨緩慢 加入至發(fā)酵上清液溶解，至硫酸銨的濃度達到飽和度的60 %，混合均勻后4°C靜置2小時； 靜置后于4°C、15000g離心15分鐘，得沉淀物a。將沉淀物a用pH7. 0、0. 02mol/L的PBS溶 液溶解后，4°C，15000g條件下離心5分鐘，回收沉淀物，并將上清液做凍干處理。計算得知， 粗酶回收率為21. 86%，總糖的回收率為15. 0%，
[0019] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實 例。
[0020] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0021] 本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明所述的方法在保持凝乳酶活力以及凝乳酶回 收率的前提下，大幅簡化了凝乳酶的制備工藝步驟；并且與使用乙醇提取凝乳酶相比，大大 節(jié)約了生產成本，操作簡便有效，安全可靠，有利于應用于工業(yè)化生產。利用飽和度為60% 硫酸銨提取所得凝乳酶的活力尤其高，凝乳酶活回收率可高達21. 86% ;同時該方法有效降 低了發(fā)酵液離心后上清液中總糖的含量，總糖含量回收率僅為15%。由此可見，本發(fā)明所述 的方法所得類芽孢桿菌