氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于制備固定化酶領(lǐng)域，具體涉及一種氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，和植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動物的血漿銅藍(lán)蛋白同屬藍(lán)色多銅氧化酶家族。漆酶廣泛分布于真菌分泌物、高等植物、少量細(xì)菌和昆蟲中。按其來源漆酶主要分為漆樹漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶。漆酶分子一般含有4個銅離子，在漆酶催化反應(yīng)的過程中，4個銅離子在酶與底物間進(jìn)行電子傳遞，從而氧化底物為自由基，隨后自由基通過漆酶進(jìn)一步催化氧化或非酶催化反應(yīng)生成各種產(chǎn)物。作為一種特殊的氧化還原酶類，漆酶能利用氧氣催化氧化多種酚類和芳香胺類化合物，底物范圍相當(dāng)廣闊。因此漆酶在廢水處理、食品加工、芳香化合物轉(zhuǎn)化、生物醫(yī)藥以及傳感器研制等方面具有重要的應(yīng)用價值。但游離漆酶在使用過程中易隨環(huán)境的變化而變性失活，且不易從反應(yīng)體系中分離，這在一定程度上限制了漆酶的工業(yè)化應(yīng)用。
[0003]然而固定化漆酶可在一定程度上提高酶的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性和極端環(huán)境穩(wěn)定性，同時還具有可重復(fù)使用和易于從反應(yīng)體系中分離出來的特點(diǎn)。對固定化漆酶的研宄和應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)漆酶工業(yè)化應(yīng)用的有效手段。按漆酶和載體結(jié)合的方式來分，漆酶的固定化方法主要分為兩類:物理方法(物理吸附法和包埋發(fā))和化學(xué)方法(離子吸附法、共價結(jié)合法和交聯(lián)法)。不過，雖然已經(jīng)報道了大量漆酶固定化的研宄工作，但仍然存在各種各樣的不足，到目前為止，還沒有一種固定化漆酶能實(shí)際應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。另一方面，由于漆酶的氧化還原電位較低，導(dǎo)致其底物范圍較窄，為了克服這一問題，人們以TEMPO、HBT等小分子物質(zhì)作為介體開發(fā)構(gòu)建了高效的漆酶-介體系統(tǒng)，以拓展漆酶的應(yīng)用范圍。但隨之而來的問題是小分子介體盡管添加量少，但由于價格普遍比較高、且無法回收利用，因而也無法推動漆酶的規(guī)模化工業(yè)應(yīng)用。
[0004]將磁性納米材料應(yīng)用于酶的固定化已經(jīng)成為研宄的熱點(diǎn)。由于磁性納米載體材料本身具備的磁響應(yīng)和粒子表面積大、粒徑小的特點(diǎn)，給固定化酶帶來了優(yōu)勢，如易分離、不易被反應(yīng)環(huán)境中的酸堿等腐蝕、穩(wěn)定性強(qiáng)、回收率高、成本低等。目前為止，固定化漆酶和固定化介體均有相關(guān)的研宄報道，但還沒有發(fā)現(xiàn)共價交聯(lián)共固定化漆酶與介體的報道。因此，本發(fā)明擬通過對磁性納米粒子Fe3O4進(jìn)行氨基修飾，并共價交聯(lián)同時固定漆酶和TEMPO介體。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)及其制備方法，用于解決游離漆酶和TEMPO介體使用效率低，不易分離和不能重復(fù)利用的問題。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為:
一種氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)，該系統(tǒng)是將漆酶和介體共同固定化在氨基硅烷化磁性納米粒子上，每Ig共固定化漆酶和介體系統(tǒng)中固定有0.2-0.5mmol介體，固定化后的漆酶酶活為80-200U/g。
[0007]所述氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟:
I)Fe304磁性納米粒子的制備:將FeCl 2和FeCl 3混合，在N2保護(hù)、攪拌、70° C水浴的條件下，加入NaOH溶液，并持續(xù)攪拌1-2 h后，將黑色產(chǎn)物分離出來，去離子水洗至中性，得到Fe3O4磁性納米粒子，然后將Fe3O4磁性納米粒子置于7 (wt)%的四甲基氫氧化銨(TMAOH)水溶液中靜置2 h，用水洗滌3-5次備用；
2)Fe3O4磁性納米粒子表面修飾3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES):將步驟I)制備得到的Fe3O4磁性納米粒子置于乙醇水溶液中，然后加入APTES，50°C，攪拌反應(yīng)10h，反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水清洗3-5次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性納米粒子；
3)介體的固定化:取步驟2)得到的氨基硅烷化磁性納米粒子置于戊二醛溶液中靜置2h，去離子水洗數(shù)次以除去多余的戊二醛，加入4-NH2-TEMP0，室溫下震蕩反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后，分離出產(chǎn)物，水洗，得到接枝了介體的納米粒子；
4)漆酶的固定:將漆酶加入50mM pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖中，再加入接枝了介體的納米粒子，35° C震蕩反應(yīng)4h后，再以50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖清洗數(shù)次，以洗去未固定的酶，得到氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)。
[0008]步驟I)中 FeCljPFeCl 3的摩爾比為 1:2-2:3。
[0009]步驟I)中NaOH溶液濃度為3 mol/Lo
[0010]步驟2)中每I g制備得到的Fe3O4磁性納米粒子置于100-200 mL乙醇水溶液中，然后加入1-3 mL APTESo
[0011]步驟2)中乙醇水溶液中乙醇與水的體積比為1:1。
[0012]步驟3)中戊二醛溶液的質(zhì)量濃度為2%。
[0013]步驟3)中每Ig氨基硅烷化磁性納米粒子加入1-3 mmol的4_ΝΗ2_ΤΕΜΡ0。
[0014]步驟4)中Ig接枝了介體的納米粒子與200 U的漆酶進(jìn)行交聯(lián)固定。
[0015]有益效果:
本發(fā)明首次將漆酶與介體共固定于磁性載體上，運(yùn)用磁納米技術(shù)制備氨基硅烷化磁性納米粒子載體，制備工藝簡單、成本低廉，并同時共價交聯(lián)漆酶和TEMPO介體，構(gòu)建了高效的漆酶-介體催化系統(tǒng)，共固定化的漆酶-介體系統(tǒng)可以通過外部磁場簡便回收，反復(fù)使用，從而提高酶和介體的利用率，降低生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0016]圖1氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)10次的連續(xù)降解脫色結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本實(shí)施例中所使用的漆酶購于SIGMA公司，所使用的4-NH2-TEMP0購于梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。
[0018]實(shí)施例1
氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟:
(OFe3O4磁性納米粒子的制備:將0.02 mo I FeCl 2和0.04 mo I FeCl 3溶于10mL去離子水中，在隊(duì)保護(hù)壞境、機(jī)械攪拌、70° C水浴的條件下加入3 mo I/L的NaOH溶液250mL，滴加完畢后持續(xù)攪拌I h。在外加磁場的作用下將黑色產(chǎn)物分離出來，并用去離子水清洗直至產(chǎn)物為中性，將得到的Fe3O4磁性納米粒子置于7 % (質(zhì)量百分比)的四甲基氫氧化銨(TMAOH)水溶液中靜置2 h，用水洗滌3-5次備用。
[0019](2)Fe304磁性納米粒子表面修飾APTES -M I g制備得到的Fe 304磁性納米粒子置于150 mL乙醇水溶液(體積比1:1)中，然后加入2 mL APTES，50°C，攪拌反應(yīng)10h。反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水清洗3-5次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性納米粒子。
[0020](3)介體的固定化:取I g制備得到的氨基硅烷化磁性納米粒子置于質(zhì)量濃度為2%的戊二醛溶液中靜置2h，去離子水洗數(shù)次以除去多余的戊二醛。加入2 mmol4-NH2-TEMP0，室溫下震蕩反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后，分離出產(chǎn)物，水洗，得到接枝了介體的納米粒子。
[0021](4)漆酶的固定:取20 U漆酶加10 mL50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖中，再加入100 mg接枝了介體的納米粒子，35° C震蕩反應(yīng)4h后，50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖清洗數(shù)次，以洗去未固定的酶，置于4°C冰箱備用，得到氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)(即漆酶與介體共固定化的磁性納米粒子)。每Ig共固定化漆酶與介體的磁性納米粒子中固定有0.4mmol介體，固定化后的漆酶酶活為120 U/g。
[0022]考察上述磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)在降解染料廢水中的應(yīng)用效果，選取酸性品紅染料，250mL錐形瓶中加入500 mg/L的酸性品紅染料5mL、10mg上述制備的共固定化磁性納米粒子和95 mL 50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖，總反應(yīng)體系為100mL。40°C下置于10rpm恒溫震蕩儀中反應(yīng)，間隔2 h測定最大吸收波長處吸光值的變化。脫色率= (1-AAtl) *100%，Atl為脫色反應(yīng)前溶液吸光值，A為脫色反應(yīng)后溶液吸光值，所有脫色反應(yīng)均重復(fù)3次取平均，計(jì)算脫色率達(dá)84.55%。而在沒有TEMPO的參與下，僅加入同等酶活力的游離漆酶，脫色率僅有2.3%。
[0023]實(shí)施例2
氨基硅烷化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟:
(OFe3O4磁性納米粒子的制備:將0.02 mo I FeCl 2和0.04 mo I FeCl 3溶于10mL去離子水中，在隊(duì)保護(hù)壞境、機(jī)械攪拌、70° C水浴的條件下加入3 mo I/L的NaOH溶液250mL，滴加完畢后持續(xù)攪拌I h。在外加磁場的作用下將黑色產(chǎn)物分離出來，并用去離子水清洗直至產(chǎn)物為中性，將得到的Fe3O4納米粒子置于7(wt) %的四甲基氫氧化銨(TMAOH)水溶液中靜置2 h，用水洗滌3-5次備用。
[0024](2) Fe3O4磁性納米粒子表面修飾APTES:?.1 g制備得到的Fe 304磁性納米粒子置于150 mL乙醇水溶液(乙醇水溶液中乙醇與水的體積比1:1)中，然后加入2 mL APTES,50°C，攪拌反應(yīng)10h。反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水清洗3-5次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性納米粒子。
[0025](3)介體的固定化:取I g制備得到的氨基硅烷化磁性納米粒子置于質(zhì)量濃度為2%的戊二醛溶液中靜置2h，去離子水洗數(shù)次以除去多余的戊二醛。加入I mmol4-NH2-TEMP0，室溫下震蕩反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后，分離出產(chǎn)物，水洗，得到接枝了介體的納米粒子。
[0026](4)漆酶的固定:取25 U漆酶加10 mL 50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖中，再加入100 mg接枝了介體的納米粒子，35° C震蕩反應(yīng)4h后，50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖清洗數(shù)次，以洗去未固定的酶，置于4°C冰箱備用，得到漆酶與介體共固定化的磁性納米粒子，即氨基娃燒化磁性納米粒子共固定化漆酶和介體系統(tǒng)。每Ig共固定化漆酶與介體的磁性納米粒子中固定有0.22mmol介體，固定化后的漆酶酶活為1