一個(gè)與小麥垂直抗葉銹相關(guān)的TaPDRABCG基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及小麥7?/?/?/?!?基因及其編碼的蛋白與其 在小麥抗葉銹性中的作用，通過VIGS技術(shù)將基因沉默，反向證明其與小麥抗葉 銹性相關(guān)。
【背景技術(shù)】
[0002] 由小麥葉銹病菌iriiiciflia)引起的小麥葉銹病是小麥的主要病害之 一，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可造成45%以上的產(chǎn)量損失（Kolmer J A，1996)。在我國(guó)，小麥葉銹病曾幾 度大面積流行，造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)?？共∑贩N的利用是控制該病害的有效方法，揭示小麥抗 葉銹性表達(dá)機(jī)制，對(duì)于有效提高小麥的抗葉銹性具有重要的意義。
[0003] ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters)是一大類跨膜蛋白，廣泛 存在于自然界生物體中，是生物體中最大的蛋白家族之一（Higgins C F，1992)。最典型 的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括：多藥抗性蛋白（multidrug resistance, MDR)，多藥抗性相關(guān)蛋白 (multidrug resistance-associated protein, MRP),多向耐藥蛋白（pleiotropic drug resistance, PDR)，其中PDR類僅在植物與真菌中被發(fā)現(xiàn)，決定著對(duì)一大類從功能、結(jié)構(gòu)上 不相關(guān)的有毒物質(zhì)的抗性（Kretzschmar T et al，2011)，該類蛋白可以參與植物防衛(wèi)反應(yīng) (Jasinski M et al，2001 ;Stukkens Y et al，2005)，與抗灰霉病、抗細(xì)菌性病害、抗小麥赤 霉病密切相關(guān)（Stukkens Y et al，2005 ;Bultreys A et al，2009 ;Mitterbauer R et al， 2003 ;尚毅等，2009)。一些PDR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以受病原物產(chǎn)生的激發(fā)子誘導(dǎo)，產(chǎn)生抗 菌、抗毒素物質(zhì)（Sasabe M et al，2002 ;Hayashi M et al，2002)，也有一些則轉(zhuǎn)運(yùn)抗真菌成 分（Kang J U et al，2010;Jasinski M et al，2001)或有毒物質(zhì)（Mitterbauer R et al， 2003)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG是植物免疫系統(tǒng)中的重要組成之一，這些蛋白參與許多次生代謝產(chǎn) 物在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)（Banasiak J et al，2013;Wang Y et al，2013)。
[0004] 關(guān)于小麥中PDR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的報(bào)道，至今只發(fā)現(xiàn)了一個(gè)決定等位基因?qū)?小麥葉銹、條銹和白粉病持久抗病性（Krattinger S G et al，2009)的ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本 發(fā)明中提到的7?/?/?沒基因編碼的PDR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與TcLr34中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相似 性僅有47%，而且其來源于TcLrl9,說明7?/?/?沒基因是小麥中一個(gè)新的ABC基因。分離 與小麥抗葉銹相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因，探明其功能對(duì)豐富小麥抗葉銹分子機(jī)制理論及開辟新 的抗病途徑具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一個(gè)從小麥中分離得到的新PDR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因， 命名為7?/?/?汝基因。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于通過VIGS技術(shù)證明7?/?/?沒基因與小麥葉銹病的抗 性相關(guān)。
[0007] 一個(gè)與抗小麥葉銹病相關(guān)的I3DR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因7?/?/?汝的cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，7?/?/?汝7(?的DNA序列如SEQ ID No. 3所示。小麥抗葉銹病相關(guān)基因7?/?/?汝7(? 編碼的蛋白質(zhì)，具有序列表中的SEQ ID No. 4所述的氣基酸序列。
[0008] 本發(fā)明是通過應(yīng)用cDNA-AFLP技術(shù)，從mRNA表達(dá)水平研究抗小麥葉銹病的TcLrl9 和感病對(duì)照Thatcher與小麥葉銹菌05-21-116③（THTS)互作時(shí)基因表達(dá)的差異，分離得到 長(zhǎng)為218 bp的PDR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因的片段，首先通過電子克隆技術(shù)對(duì)該片段進(jìn)行延伸得到 長(zhǎng)477 bp的序列，其次利用RACE技術(shù)，分別設(shè)計(jì)3' RACE和5' RACE引物，進(jìn)行擴(kuò)增，得 到一個(gè)長(zhǎng)為4359 bp的拼接序列，對(duì)該序列進(jìn)行cDNA和DNA的驗(yàn)證，最終在cDNA中擴(kuò)增出 4182 bp的片段，在DNA中擴(kuò)增出6452 bp的片段。利用大麥條紋花葉病毒(fere# mosaic ri/YAs^BSMV)介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)開展了該基因的功能驗(yàn)證，證明該基因與小麥的 小種轉(zhuǎn)化抗葉銹性相關(guān)。從而獲得了一個(gè)新的與抗葉銹相關(guān)的ABCG基因 --TaPDMBCG。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明獲得的小麥PDR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因7?/?/?說i?通過病 毒介導(dǎo)的基因沉默試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)原本抗小麥葉銹病的材料出現(xiàn)感病現(xiàn)象，證明參 與了小麥對(duì)接種葉銹病生理小種的防御反應(yīng)，是一個(gè)抗小麥葉銹病的相關(guān)基因。本發(fā)明中 基因的克隆及其在小麥抗葉銹中的作用，對(duì)于豐富抗葉銹分子機(jī)制理論具有重 要意義，對(duì)抗病育種的實(shí)踐工作具有指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0010] 圖1是從TcLrl9和Thatcher中獲得的差異表達(dá)的PDR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因的片段。 箭頭表示差異片段；1-4分別為：未接菌Thatcher、接菌Thatcher、未接菌TcLrl9、接菌 TcLrl9〇
[0011] 圖2是7?/?/?汝電子克隆的擴(kuò)增結(jié)果。M :DL2000 Marker ;1 :在小麥TcLrl9中 電子克隆的片段。
[0012] 圖3是以電子克隆的序列為靶序列進(jìn)行Y RACE的擴(kuò)增結(jié)果，即7?/?/?說i?的 3' RACE的擴(kuò)增結(jié)果。M :DL2000 Marker ;1 # RACE的擴(kuò)增片段。
[0013] 圖4是以電子克隆的序列為靶序列進(jìn)行Y RACE的擴(kuò)增結(jié)果，即7?/?/?說i?的 5' RACE的擴(kuò)增結(jié)果。M :DL2000 Marker ;1 # RACE的擴(kuò)增片段。
[0014] 圖5是將3' RACE和5' RACE的序列進(jìn)行拼接的模式圖。
[0015] 圖6是以3' RACE和5' RACE拼接的序列為靶序列設(shè)計(jì)引物在小麥TcLrl9中 進(jìn)行cDNA和DNA擴(kuò)增的結(jié)果，即7?/?/?汝的cDNA和DNA擴(kuò)增的結(jié)果。M : λ DNA/Hind III Marker ;C :cDNA中的擴(kuò)增片段；D :DNA中的擴(kuò)增片段。
[0016] 圖7是從基因7?/?/?說i?中選取的沉默片段的擴(kuò)增結(jié)果圖。M :DL2000 Marker ; 1-4均是在TcLrl9中擴(kuò)增的沉默片段。
[0017] 圖8是從基因中選取的沉默片段連接到Y(jié)載體上雙酶切驗(yàn)證的結(jié)果 圖。M :DL2000 Marker ;1 : γ :TaPDRABCG 雙酶切的結(jié)果。
[0018] 圖 9 是 α、β、γ :〇〇、γ :PDS 和 Y :TaPDRABCG 線性化后的結(jié)果。M :DL2000 Marker ;1-5 分別為 α、β、γ :〇〇、γ :PDS、Y :TaPDRABCG。
[0019] 圖 10 是 α、β、γ :〇〇、γ :PDS 和 Y :TaPDRABCG 體外轉(zhuǎn)錄后的結(jié)果。M :DL2000 Marker ;1-5 分別為 α、β、γ :〇〇、γ :PDS、Y :TaPDRABCG。
[0020] 圖11是7?/?/?說i?在抗小麥葉銹病的TcLrl9上進(jìn)行功能驗(yàn)證的結(jié)果圖。CK :既 沒有接種病毒又沒有接種小麥葉銹菌的TcLrl9 ;19+ :只接種小麥葉銹菌THTS的TcLrl9 ; BSMV = OO :接種病毒空載體和小麥葉銹菌THTS的TcLr 19 ;BSMV:H)S :接種攜帶沉默/??基因 的病毒載體和小麥葉銹菌THTS的TcLrl9 ;BSMV:ABC :接種攜帶沉默基因的病毒 載體和小麥葉銹菌THTS的TcLrl9 ;Tc+ :只接種小麥葉銹菌THTS的感病對(duì)照Thatcher。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例(一)、基因克隆 1. TcLrl9和Thatcher中PDR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因差異片段的獲得 利用cDNA-AFLP技術(shù)，從mRNA表達(dá)水平研究抗小麥葉銹病的TcLr 19和感病對(duì)照 Thatcher與小麥葉銹菌05-21-116③（THTS)互作時(shí)基因表達(dá)的差異，通過對(duì)功能已知的基 因分析，分離得到長(zhǎng)為218 bp的PDR類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因的片段（圖1)。
[0022] 2. 7?/?/?汝的電子克隆 2.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)218 bp片段設(shè)計(jì)電子克隆引物19F :5' - GCCCCTGAAACGTACAACTT - 3'和19R : 5' - ACGGAAGAAGAGCGTCATTG - 3'。以小麥 TcLrl9 的 cDNA 為模板