抗艾滋病藥物篩選方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種抗艾滋病藥物的篩選方法。
【背景技術】
[0002]獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquiredimmunodeficiency syndrome, AIDS，音譯為艾滋病)，是一種由人類免疫缺乏病毒(簡稱HIV)的反轉錄病毒感染后，因免疫系統(tǒng)受到破壞，逐漸成為許多伺機性疾病的攻擊目標，促成多種臨床癥狀，統(tǒng)稱為綜合癥，而非單純的一種疾病，是一種惡性傳染病。2013年世界衛(wèi)生組織公布稱全球有200多萬年齡在10歲和19歲之間的青少年攜帶艾滋病毒，另有數百萬青少年面臨著感染危險；另外，據國家衛(wèi)生計生委公布，截至2013年9月30日，全國共報告現存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人約43.4萬例。
[0003]目前，艾滋病疫苗尚未研制成功，藥物治療是用于抗AIDS和HIV感染的主要手段，經美國FDA批準上市的抗HIV藥物已有30多種。臨床上治療AIDS和HIV感染所采用的高效抗逆轉錄病毒療法(highly active ant1-retrovirus therapy, HAART)可以降低病毒對免疫系統(tǒng)的損害，一定程度上恢復其免疫功能，提高AIDS患者和HIV攜帶者的生存時間和生活質量。但是，由于HIV的高度變異性使HAART的治療效果不穩(wěn)定，目前已上市的藥物不能將HIV病毒完全清除，而且毒副作用嚴重，影響患者對治療方案的依從性。因此，急需尋找高效、低毒的新型抗艾滋病藥物。
[0004]HIV-1逆轉錄酶(RT)是一個由P66和P51亞基組成的異二聚體酶，由HIV pol基因編碼，分別有560和440個氨基酸殘基。是一種具有RNA引物RNA依賴的DNA聚合酶活性(RDDP)和DNA依賴性DNA聚合酶活性(DDDP)和核糖核酸酶(RNase) H活性多功能酶，在HIV-1生命周期早期過程中發(fā)揮重要作用。
[0005]目前感染的艾滋病毒主要是HIV-1病毒，HIV-1病毒由兩條單鏈RNA組成，以氫鍵相連接穩(wěn)定存在于衣殼蛋白內。HIV-1的基因組很小，不到10 kb，在5’端有帽結構，3’端有poly (A)尾巴。在HIV感染的過程中，逆轉錄酶(reversetranscriptase, RT)、整合酶(integrase, IN)、蛋白酶(protease, PR)三種關鍵酶在整個HIV生命周期中起到決定性作用。
[0006]逆轉錄是病毒細胞核分解后，在RT的手掌區(qū)，以單鏈病毒基因RNA引物結合部位(viral primer binding site, PBS)為模板、以細胞的t RNA的3’端為引物，在RT的RNA依賴的 DNA 聚合酶(RNA-dependent DNApolymerase, RDDP)活性作用下，合成 RNADNA 雜交鏈，繼而在RT的核糖核酸酶H (RNase H)活性下，剪切下RNA，保留DNA單鏈，再以DNA負鏈為模板，在RT的DNA依賴的DNA聚合酶(DNA- dependent DNA polymerase, DDDP)活性作用下，合成DNA雙鏈，再經過DNA整合酶的作用整合到宿主細胞的DNA上，病毒基因就會進入到宿主細胞的DNA中。在此過程中可能產生病毒的突變體。在病毒的蛋白質整合酶與宿主的DNA修復酶共同作用下，病毒基因組與宿主DNA連接起來，形成宿主染色體DNA。
[0007]尋找高效、低毒的抗艾滋病藥物，始終是本領域的研宄熱點，目前國內抗艾滋病藥物的篩選方法層出不窮，仍鮮有簡便、高效篩選抗艾滋病藥物的方法報道。

【發(fā)明內容】

[0008]針對上述不足，本發(fā)明提供一種抗艾滋病藥物的篩選方法，可以有效、快速的完成抗艾滋病藥物的篩選。
[0009]本發(fā)明提供一種抗艾滋病藥物的篩選方法，包括以下步驟:
(1)制備模板和引物:在對Hiv-1反轉錄起始被設計在RDDP活性和RTRNase H裂解活性的藥物靶點，以PBS為模板、以PBS互補的DNA為引物；所述的PBS模板是2uL ImM 21nt HIV RNA template ( 3’ -ACAAGC CCGCG GUGAC GAUCU-5’)，所述的 DNA 引物為 IuL ImM11 nt DNA primer (5，-γ-32P-TGT TCG GGC GCC Α_3’)；
(2)依次加入97μ L H2O, 70°C, 10 min,緩慢冷卻到室溫；
(3)取template/primer 溶液 IuL,依次加入緩沖液，水，DTT, dNTPS、藥物、HIV RT0
[0010](4)制備 10 μ L 反應體系，template/primer 的濃度為 luM，50 mM pH 8.0tris-HCl，60 mM KCl, 8mM MgCl2 ,ImM DTT, 500 mM dNTPS, 0.5 U HIV RT，于 37°C 反應 lh。
[0011](5)通過丙稀酰胺電泳分離，Storm 840掃描，定量分析，計算藥物的HIV RT抑制率。
[0012]以上步驟(I)中以21 nt PBS的HIV RNA基因組PBS作為模板，11 nt DNA作為引物，即細胞tRNA3Lys互補序列的一部分。由DNA集成技術合成，其序列的選擇如下:
lint DNA 引物:5’ - TTCGGGCGCCA-3，
21 nt HIV RNA template: 3’ -ACMGaXGCGGUGACGAUCU-5’
2Int HIV RNA 模板:3’ - ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’
lint tRNA3Lys引物:11 nt tRNAlys3 primer: 5，-UUCGGGCGCCA-3’
5， - UUCGGGCGCCA-3’
14nt RNA-DNA 引物:14 nt RNA-DNA primer: 5，-UUCGGGCGCCAdCdTdG-3’ (the lastthree bases are DNA)
5’ - UUCGGGCGCCADCDTDG-3’(最后的三個堿基是 DNA)。
[0013]上述中，以PBS互補的DNA為引物；還可以擴展以8-36 nt DNA作為引物，是指細胞tRNA3LysS補序列的一部分作為引物。
[0014]以上所述的RNA的PBS模板、DNA引物的5’末端是用[γ-32P] ATP (3000 Ci/mmol)標記，標記的過程包括以下步驟:加入6 μ L2 mM的RNA模板或引物，IyL T4多核苷酸激酶，2 μ L[ γ -32P] ATP (3000 Ci/mmol)和I μ L Τ4多核苷酸激酶緩沖液，37。C培養(yǎng)I小時，然后置于65°C滅活25分鐘。加入l.lyL 3M NaCl和33.3 μ L乙醇于-20° C下15分鐘，高速離心機(13 K)離心20分鐘分離得到放射性標記的RNA或DNA，處理廢液。底部的白色小顆粒室溫干燥15分鐘后加入300 μ L水。
[0015]上述對HIV-1反轉錄起始被設計在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的藥物靶點，還可以15-40 nt PBS的HIV RNA基因組PBS作為模板，8-36 nt DNA (即細胞tRNA3LysS補序列的一部分)作為引物，通過抑制DNA聚合酶，促進RNase H酶靶向HIV逆轉錄酶藥物篩選。
[0016]上述中，還要進行DNA聚合酶活性的測定、RNase H活性的測定、DNA聚合酶的篩選模型和優(yōu)化RT濃度和RNase H活性的反應時間篩選系統(tǒng)，以下分別進行介紹:
1、DNA聚合酶活性的測定
為測量RT抑制DNA聚合酶活性，采用采用21 ntRNA模板和5’ -放射性標記的IlntDNA引物進行篩選。
[0017](I)制備10 μ L RNA混合液:400 nM的RNA模板，200 nM 5’ -放射性標記的DNA引物，使終濃度緩沖液中含有 50 mM Tris-HCl (pH 8.0，25°C )，100 nM KCl, I mM EDTA, ImM 二硫蘇糖醇，8 mM MgCl2;
(2)混合液70°C變性10分鐘，緩慢冷卻后加入Iμ L核苷三磷酸dNTPs (I mM)；
(3)加入不同濃度的抑制劑、藥物和RT(0.2 U到IUXEMD Chemical, Inc.)，于37°C下培養(yǎng)30分鐘至180分鐘；
(4)加入10μ I緩沖液(1nM EDTA, pH 8，90%甲酰胺(V/V)，和0.1%考馬斯亮藍和溴酚藍)終止反轉錄。
[0018](5)滅活的7 M尿素、15% (V/V)聚丙烯酰胺和IXTBE緩沖液在1000 V條件下聚丙烯酰胺凝膠電泳I小時。結果采用storm 840進行分析。
[0019]2、RNase H活性的測定
為了測量RNase H RT的活性，選擇5_放射性標記的21 nt RNA模板和lint DNA引物。
[0020](1)10 μ L反應體系測定RNA / DNA雜交雙鏈基板(200 nm)。終濃度緩沖液中含有50 mM Tris-HCl (p H 8.0，25°C )，10nM KCl, I mM EDTA, I mM 二硫蘇糖醇，8 mM MgCl2;
(2)70°C變性10分鐘，緩慢冷卻后加入I μ L核苷三磷酸dNTPs (I μ M);
(3)加入不同濃度的抑制劑、參考藥物和HIV-1逆轉錄酶(0.1U到1U)，37°C培養(yǎng)30分鐘至120分鐘；
(4)加入2X10μ I緩沖液(1nM EDTA，pH 8，90%甲酰胺(V / V)，和0.1%的二甲苯胺和溴酚藍)終止反轉錄。
[0021](5)滅活的7 M尿素、15% (V / V)聚丙烯酰胺和IXTBE緩沖液在1000 V條件下聚丙烯酰胺凝膠電泳I小時。結果采用storm 840進行分析。
[0022]3、DNA聚合酶的篩選模型
用不同濃度的模板/引物，RT和反應時間，最好的RRDD活性篩選模型如下:
IlntDNA 引物:5，_[γ」2Ρ] ATP-TTCGGGCGCCA-3’
2Int HIV RNA 模板:3，-ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5，<