一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測領域，涉及一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的 試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是一種慢性致死性傳染病，由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV)引起，分為人類免疫缺陷病毒1型（HIV-I)和人類免疫缺陷病毒2型（HIV-2)，HIV-I 是目前全球包括中國在內流行的主要毒株，HIV-2型目前只在西非流行。HIV感染后導致 人體免疫機能缺陷，從而發(fā)生機會性感染和腫瘤等一系列臨床綜合征，病死率幾乎達100%。 艾滋病至今尚無確切有效的治療藥物，HIV感染的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷是防止艾滋病流行 的重要手段，也是艾滋病預防控制工作的重要組成部分。
[0003] 實驗室檢測是診斷HIV感染的主要依據(jù)，根據(jù)檢測水平的不同，可分為蛋白水平、 細胞水平和基因水平的檢測。主要包括抗體和抗原檢測、病毒分離和病毒核酸檢測等。提 高HIV檢測的敏感性，縮短窗口期是HIV早期診斷的主要研宄目的。
[0004] 蛋白水平檢測主要包括HIV抗原檢測及其機體針對抗原產(chǎn)生的特異性抗體，是 HIV感染診斷中最常用方法，可分為初篩實驗和確認實驗，分別以ELISA和Western blot方 法為代表，主要有"窗口期"長（14天至2個月）及容易受干擾物影響出現(xiàn)假陽性等缺點。
[0005] 細胞水平檢測主要以細胞分離培養(yǎng)和CD4+淋巴細胞計數(shù)為主，前者能夠直接檢 測病毒，專一性很強，有高度的特異性，不會出現(xiàn)假陽性，且可以獲得樣品中原始病毒株，可 進一步進行耐藥性和生物學特性研宄。但是其敏感性較低，周期長，費用高，需要在P3實驗 室進行，易造成實驗室感染，故臨床應用較少。后者作為直接測定免疫功能的方法，可以用 于檢測HIV感染進展狀況、判斷預后，了解機體免疫狀態(tài)進行疾病分期，監(jiān)測抗病毒治療效 果等，但由于昂貴儀器及大量標本要求，無法對HIV早期感染進行檢測，從而極少在HIV篩 查中應用。
[0006] 病毒核酸檢測，目前以病毒載量（RNA)檢測為主，利用分子生物學技術檢測HIV 病毒核酸，不僅可以定性地檢測樣本中是否含有HIV病原體，輔助早期診斷HIV感染，縮 短窗口期；還可以對樣本中病毒進行定量，即檢測病毒載量，用于病程監(jiān)控、指導治療方案 及療效判定和預測疾病進展等。目前國內外已上市的病毒載量檢測試劑盒檢出限在20~200 拷貝/mL之間，低于500拷貝/mL定量不穩(wěn)定，另外標本收集及保存要求較高，RNA容易降 解，而且不同實驗室和不同方法間病毒載量測定值變異很大，病毒載量絕對值不能直接比 較。HIV在感染細胞時通過逆轉錄作用形成大量前病毒DNA，部分整合到細胞基因組中，穩(wěn) 定不易降解。因此近年來，研宄人員開發(fā)HIV前病毒DNA檢測方法來替代病毒載量檢測，據(jù) 文章報道的HIV-I DNA最低檢出限在10拷貝/百萬細胞以上。
[0007] 此外，目前HIV檢測方法所用的標本主要來自HIV感染者或病人的血漿或全血。但 是這種些樣本在采集、分離、保存和運輸過程中不可避免地會遇到一些難題，如一些實驗室 條件欠完善地區(qū)并不能及時地將采集的全血分離、凍存。此外，受生物危險品運輸限制，全 血或血漿需專人冷鏈運輸。為了解決上述問題，醫(yī)護人員采用美國食品和藥品管理局（FDA) 批準的國際通用903#濾紙，制備成干血斑樣本，為篩查工作帶來很多便利，如：可常溫保存 運輸，常溫下可保存3個月以上，無病毒感染等。由于干血斑標本采樣量少（50~75 μ L全 血)，使其檢測靈敏度比血漿或全血標本檢測靈敏度低10倍左右，一定程度上影響干血斑在 HIV篩查應用。

【發(fā)明內容】

[0008] 為了解決上述問題，本發(fā)明通過開發(fā)一種簡單高效的干血斑提取試劑，以及宄篩 選出高靈敏和高特異性的引物序列和檢測探針，并設置特定的PCR反應程序和條件，構建 了高敏感干血斑標本中HIV-I DNA PCR檢測試劑盒及檢測方法。
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的方 法。
[0011] 本發(fā)明所采取的技術方案是： 一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒，包含有核酸提取液和PCR反 應液，所述的PCR反應液中含有PCR引物組和檢測探針； 所述引物組選自引物組1、引物組2和引物組3中的至少一組，其中： 引物組 1 由 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID Ν0:5 和 SEQ ID NO :6 組成； 引物組 2 由 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 組成； 引物組 3 由 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成； 所述探針情況如下： 當試劑盒中含有引物組1時，該試劑盒至少含有探針SEQ ID NO: 15或其核苷酸互補序 列； 當試劑盒中含有引物組2時，該試劑盒中含有探針SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或者該些序列的核苷酸互補序列中的至少一條探針； 當試劑盒中含有引物組3時，該試劑盒含有探針SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22或者該些序列的核苷酸互補序列中的至少一條探針。
[0012] 進一步的，上述核酸提取液含有：10~50mM Tris-HCl (pH8. 0)、30~50mM KC1、 5~10%0^16叉100、0.5~1%1'1^〇11父-100、0.5~1%咿-40和10~5〇1111辛酸納。
[0013] 進一步的，上述探針序列5'端標記的熒光基團為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種， 探針序列3'端標記的淬滅基團為TAMRA、MGB、BHQ中一種。
[0014] 進一步的，上試劑盒還包含細胞定量引物組和細胞定量探針； 所述細胞定量引物組由 SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25和 SEQ ID NO: 26 組成； 所述探針為含SEQ ID NO:27或者為其核苷酸互補序列； 細胞定量探針序列所標記的熒光基團可從FAM、HEX、VIC、CY5、TET選擇，但不同于權利 要求3所述探針的熒光基團。
[0015] 進一步的，上試劑盒還含有：陰性對照、陽性定量參考品和含有酶與UNG酶的 酶系。
[0016] 進一步的，上述的陽性定量參考品為8E5或Ach2細胞株基因組，用于同時對HIV-I DNA及細胞數(shù)定量。
[0017] 一種干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的檢測方法，包括以下步驟： 1) 干血斑核酸提?。?用打孔器將干血斑打孔，將打孔的樣品置于離心管中；加入滅菌水，劇烈震蕩3~5秒， 室溫放置30分鐘后震蕩3~5秒；12000rpm離心I. 5~2. 5分鐘，去上清液，留足夠上清液蓋沒 沉淀；加入核酸提取液100 μ L，震蕩3~5秒，放置于56°C震蕩孵育25~30分鐘；于95~100°C 孵育5~10分鐘；12000rpm離心3~5分鐘，轉移上清到新離心管中作為DNA模板； 2) PCR反應體系： PCR 反應液 29. 2 μ L ; 酶系 0.8yL; DNA 模板 20 μ L ; 3) PCR反應程序： 以ΑΒΙ7500為例，第一步：37°C 5分鐘；第二步：95 °C 10分鐘；第三步：95 °C 15 秒，62~68 °C 15 秒，72°C 20 秒，5~8 個循環(huán)；第四步：95 °C 15 秒，62~65 °C 15 秒，72°C 20秒，5~8個循環(huán)；第五步：95°C 15秒，60°C 1分鐘，40個循環(huán)；60 °C時采集 熒光； 4) 結果分析： 反應結束后自動保存結果，對HIV-I DNA的擴增曲線和相應細胞擴增的曲線進行分別 分析；點擊Analyze進行分析，使Std Curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即Correlation 數(shù)值介于-1. 〇〇. 98,然后到Plate窗口下記錄定量結果； 細胞中HIV-I DNA含量結果計算： 同一份標本中，用2條標準曲線定量的HIV-I DNA定量值除以細胞定量值，得出標本中 每個細胞中HIV-I DNA含量。
[0018] 進一步的，在上述整個檢測過程中，需保證各樣品滿足以下質量要求： ① 陰性對照：HIV DNA擴增曲線無 CT值顯示； ② 陽性定量參考品的結果均為陽性，Ct值<30,且2條標準曲線線性相關系數(shù)0.98 ^ r ^ 1 ； 以上要求需要在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是： 1) 本發(fā)明的干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型PCR檢測試劑盒靈敏度可達到血漿或 全血標本檢測靈敏度，但更方便標本收集、存儲、運輸； 2) 本發(fā)明技術開發(fā)干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型PCR檢測試劑盒及其檢測方法 的檢測方法可以同時對HIV-I D