制備誘導多能干細胞的方法及其應用
【專利說明】
[0001] 交互參照的相關申請
[0002] 本專利申請主張于2012年10月1日申請的美國臨時專利申請第61/708, 128號 的優(yōu)先權，在此將其全文并入以為參照。本申請案亦主張于2012年10月24日申請的美國 臨時專利申請第61/717, 871號的優(yōu)先權，在此將其全文并入以為參照。
技術領域
[0003] 本發(fā)明概括而言涉及一種制備誘導多能干細胞的方法，及一種經(jīng)由此方法使細胞 回春的方法。本發(fā)明亦涉及一種用于治療組織損傷的方法。
【背景技術】
[0004] 于產(chǎn)生誘導性多能干細胞（iPSCs)的細胞的重新編程技術為干細胞生物學與再 生醫(yī)學的具有前景的策略。以往資料已顯示核的重新編程可通過三種方法以實驗地誘導： 核轉移、細胞融合或轉錄因子的強制表現(xiàn)（Yamanaka與Blau，2010)。成熟卵母細胞與胚胎 干細胞（embryonic stem cell，ESCs)含有重新編程因子（蛋白質(zhì)、RNAs、脂質(zhì)與小分子） 是可為所知的，該因子可使此等體細胞進行有效的核的重新編程，為一種將體細胞轉換成 多能性狀態(tài)的過程（Jullien等人，2010 ;Wang等人，2010)。最近的證據(jù)強烈顯示核蛋白在 重新編程過程期間的染色質(zhì)再成型與表觀遺傳的修飾中調(diào)節(jié)的樞軸角色（Jullien等人， 2011)。然而，于細胞的重新編程期間核中因子調(diào)節(jié)過程的確切分子機制仍然未確定。
[0005] 誘導多能干細胞（iPSCs)首先由2012年獲得諾貝爾醫(yī)學獎的Shinya Yamanaka的 團隊開展。Yamanaka成功地通過已被鑒定為于胚胎干細胞（ESCs)中特別重要的基因的轉 染以制造 iPSCs，并分離用于制造多能性干細胞的必要的四個關鍵多能性基因：0ct-3/4、 Sox2、c-Myc與Klf4 (Takahashi與Yamanaka，2006)。前人繼而發(fā)現(xiàn)通過轉錄因子誘導的 核的重新編程重設了表觀遺傳的標志，導致體細胞的表體基因組的整體逆轉至類ESC狀態(tài) (Maherali等人，2007 ;Papp與Plath，2011)。然而，涉及后轉譯交互作用及修飾的機制仍然 未確定。以質(zhì)譜學（mass spectrometry，MS)為基礎的蛋白質(zhì)體學分析為現(xiàn)有方法中對干 細胞生物學中蛋白質(zhì)體譜的整體調(diào)查最強大的工具（Rigbolt等人，2011 ;Van Hoof等人， 2009)。雖然表觀遺傳的事件中核蛋白質(zhì)的重要性已被關注（Jullien等人，2010)，但關于 所涉及的官能性蛋白質(zhì)及調(diào)節(jié)重新編程與維持多能性的機制仍所知甚少。
[0006] Yamanaka等人于US專利第8, 058, 065號（2009年6月9日申請并于2011年11 月15日頒證）中亦提供通過經(jīng)引入基因0ct3/4、Klf4、c-Myc及Sox2的體細胞的核重新編 程而制備誘導多能干細胞（iPSC)的方法。該通過誘導分化該所獲得的iPSC而制備體細胞 的方法揭示于美國專利第8, 129, 187號中（2010年2月18日申請并于2012年3月6日頒 證）。然后，Yamanaka等人提供通過引入編碼0ct3/4、Klf4及Sox2且不含c-Myc的基因 制備誘導多能干細胞（iPSC)的方法（美國專利第8, 278, 104號，2008年6月13日申請并 于2012年10月2日頒證）。Sakurada等人提供一種使用兩或多種由包含外生的0ct3/4、 Sox2與Klf4基因的iPSCs分化的分離的細胞群體而用于藥物探索的方法及平臺（美國專 利第8, 257,941號，2009年6月12日申請并于2012年9月4日頒證）。
[0007] Irion提供一種用于自血液細胞中產(chǎn)生無整合的人類誘導多能干細胞的方法，是 使用一或多種以重新編程因子（a)0ct4、Sox2、Klf4 及 c-Myc ; (b)0ct4、Sox2 及 Klf4 ; (c) 0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc 及 Nanog ;或（d) Oct 4、Sox2、Lin-28 及 Nanog 編碼的 DNA 表現(xiàn)載 體（美國專利第8,048,675號，2010年5月12日申請并于2011年11月I日頒證）。
[0008] 因此，使用蛋白質(zhì)體學的途徑鑒別涉及核重新編程的調(diào)節(jié)中的新穎核因子，從而 使闡明于重新編程過程期間核中復雜分子網(wǎng)路為重要的。
[0009] 誘導多能干細胞（iPSCs)可通過基因或化學試劑的轉導作用從成體細胞被重新 編程。iPSCs享有胚胎干細胞（ESCs)的特征且可以自我更新及三胚層（tridermal)分化， 提供于疾病模式化的資源及于移植的潛在來源。iPS細胞相比于胚胎干（embryonic stem， ES)細胞的主要優(yōu)點為iPS細胞可由患者自身的體細胞衍生，由此避免移植后的免疫抗拒 及因使用ES細胞而引起在倫理上的關注。近來，人類囊腫纖維化iPSCs被示范以制造疾病 特定的肺前驅細胞及最后于免疫不全的小鼠中形成呼吸皮膜（Mou H, Zhao R，et al. Cell Stem Cell 2012;10:385-397)。此外，人類iPSCs可形成肌原的前驅子及神經(jīng)元，致使其 移植至有神經(jīng)肌肉疾病或中風疾病的模式生物后產(chǎn)生功能的回復（Darabi R et al. Cell Stem Cell 2012;10:610-619;及 Oki K et al. Stem Cells 2012;30:1120-1133)。然而， iPSCs的可能保護性角色及根本的機制仍然未知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 于本發(fā)明中不可預期的發(fā)現(xiàn)誘導多能干細胞（iPSCs)可成功地由轉染體細胞以 表現(xiàn)0ct3/4、Sox2及Parpl而沒有具致癌性的c-Myc及/或Klf4而制備。于本發(fā)明中，亦不 可預期地發(fā)現(xiàn)干擾素（IFN)-Y可誘導性蛋白質(zhì)-IO(IP-IO)(-種負責修復或再成型組織 傷害修復的趨化激素）涉及于由多能干細胞（iPSCs)或iPSC-條件化的培養(yǎng)基（iPSC-CM) 所介導的效應。
[0011] 據(jù)此，于一方面，本發(fā)明提供一種不使用c-Myc及/或Klf4而從體細胞制備誘導 多能干細胞（iPSCs)的方法。該方法包括（a)轉染分離的體細胞以表現(xiàn)0ct3/4、Sox2及 Parpl ;及（b)在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)如在步驟（a)中所獲得的該已轉染的體細胞，由此將該 體細胞轉換成iPSCs及維持多能性及自我更新能力。
[0012] 于另一方面，本發(fā)明提供一種從體細胞制備誘導多能干細胞（iPSCs)的方法，包 括：(a)使分離的體細胞接觸或暴露于0ct3/4、Sox2及Parpl ;及（b)在適當?shù)臈l件下培養(yǎng) 如在步驟（a)中所獲得的該體細胞，由此將體細胞群體的至少一亞群轉換成為iPSCs及維 持多能性與自我更新能力。
[0013] 于又一方面，本發(fā)明提供一種重新編程成體細胞的方法，包括將被PAR基化的/可 被PAR基化的蛋白質(zhì)或具有PAR基化活性的酵素投予至細胞。
[0014] 于再一方面，本發(fā)明亦提供一種將個體中細胞或衰老細胞回春化的方法，包括將 可被PAR基化的蛋白質(zhì)或具有PAR基化活性的酵素投予至個體。
[0015] 于另一方面，本發(fā)明提供一種用于誘導IP-10的分泌的方法，包括將有效量的 iPSCs或iPSC-條件化的培養(yǎng)基投予至有需要的個體。
[0016] 于另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療組織傷害的方法，其包括將治療有效量的 iPSCs或iPSC-條件化的培養(yǎng)基投予至有需要的個體，其中該治療有效量為能夠誘導足夠 以抑制發(fā)炎反應的IP-IO的量。
[0017] 于再另一方面，進一步提供一種組合物，其包括用于個體中誘導IP-?ο的分泌的 iPSCs或iPSC-條件化的培養(yǎng)基。
[0018] 應理解前述一般敘述及以下詳細敘述兩者僅為例示性及闡明性，并不限制本發(fā) 明。
【附圖說明】
[0019] 前述的摘要以及以下本發(fā)明的詳細敘述，當與附圖一并閱讀時將可更加理解。
[0020] 于圖中：
[0021] 圖1顯示于多能或分化狀態(tài)的Parpl與PAR基化活性。圖面A :于Re-7iPSCs中 ALP與SSEA-I的型態(tài)及染色。BF，亮視野。比例尺=100μπι。來自Re-7iPSCs與MEFs的核 蛋白質(zhì)通過ID-DIGE分離成五部份。圖面B :圓餅圖，顯示于來自iPSCs的所有核蛋白質(zhì)中 基因功能的GO分類。圖面C :于多能干細胞中0ct4、Nanog、c-Myc、Parpl及PAR基化活性 的表現(xiàn)，包括以OSKM或OSK轉染的iPSCs與ESCs。圖面D :上方：多能性因子0ct4、Sox2、 Klf4、c-Myc及Parpl的展開；下方：于重新編程過程期間的PAR基化活性。圖面E :于分化 6天后EBs中的Parpl表現(xiàn)與PAR基化活性。圖面F :左方：Re-7iPSCs分化成類骨、類肝或 類神經(jīng)元的細胞，分別由茜素紅、PAS及神經(jīng)元特定標記Nestin與MAP2的陽性染色確認。 比例尺=100 ym。右方：偵測于 Re_7iPSCs 中 Parpl、Parp2、TopII-alpha、0ct4、Sox2 及 Klf4蛋白質(zhì)，于分化成指定的特定譜系之前及之后。蛋白質(zhì)印跡是代表獨立的細胞配制物 的三個分別的實驗。
[0022] 圖2顯示Parpl表現(xiàn)與PAR基化活性對iPSC重新編程系至為重要的。圖面A :蛋 白質(zhì)印跡確認在重新編程11日（Repro D11)時Parpl剔降型（knockdown)于Parl表現(xiàn)剔 降的效應。圖面B :于以OSKM轉染的MEFs中的Parpl剔降于重新編程期間影響自我更新 與增生的能力。圖面C :以ALP染色的重新編程細胞示范以Parpl剔降的iPSCs的群體尺 寸。圖面D :在R印ro Dll時以Parpl剔降的iPSCs中對ESC標記SSEA-I及0ct4的免疫 螢光染色。圖面E :于OSK-或OSKM-轉染的MEFs中偵測Parpl與0ct4表現(xiàn)于R印ro Dll 的過度表現(xiàn)的Parpl。圖面F :以ALP染色的重新編程細胞及具有或不具有Parpl過度表現(xiàn) (左方）以OSKM轉染、具有或不具有Parpl過度表現(xiàn)（中間）以OSK轉染及具有或不具有 Parp2過度表現(xiàn)（右方）以OSK轉染的MEFs的相對重新編程效率，于21日之后-重新編 程。圖面G :左方：以ALP染色的重新編程細胞及以PAR基化抑制因子PJ-34處理的重新編 程細胞（OSKM)與沒有抑制因子的細胞相比的重新編程效率。以ShRNA-Parpl (中間）處理 的或shRNA-混碼對照組（右方）處理的OSKM-轉染的MEFs，于21日之后-重新編程。蛋 白質(zhì)印跡是代表獨立的細胞配制物的三個分別的實驗。此處顯示的ALP染色為六個獨立實 驗的平均值土 SD。*P〈0. 05相對親代。
[0023] 圖3顯示Parpl可替代Klf4或c-Myc以產(chǎn)生嵌合體小鼠。圖面A :以ALP-陽性群 體計數(shù)比較〇SK、OSM與OSP之間的重新編程效率。圖面B :流動式細胞測量術顯示在重新 編程0日（左方）或11日（右方）時于以對照載體或以Parpl轉染的MEFs的細胞循環(huán)分 析。圖面C :于重新編程期間在Nanog-GFP報告子MEF株中由OSP轉染化的Nanog-GFP的 表現(xiàn)活性。圖面D :產(chǎn)OSP的iPSCs可穩(wěn)定地培養(yǎng)至至少50個具高ALP活性的繼代。圖面 E :RT-PCR顯示在第50繼代時于產(chǎn)OSP的iPSCs中之類-ESC基因特征（signature)。圖面 F :免疫螢光法指出在第50繼代時于OSP-iPSCs中多能性因子的蛋白質(zhì)表現(xiàn)。圖面G :亞硫 酸氫鹽定序顯示于MEFs與OSP-iPSCs中0ct4與Nanog的啟動子的甲基化譜?？招呐c填滿 的圓圈分指示未甲基化及甲基化的CpG二核苷酸。圖面H :活體外（Ex vivo)生檢體與組 織分析揭露于裸小鼠中OSP-iPSCs的腎下（subrenal)接枝中的畸胎瘤形成。OSP-iPSCs的 搬運力產(chǎn)生嵌合體小鼠，如被覆顏色所確認（右下方）。比例尺=1〇〇μπι。顯示于此處的 ALP染色為六個獨立實驗的平均值土SD。蛋白質(zhì)印跡或其他數(shù)據(jù)是代表獨立的細胞配制物 的三個分別的實驗。
[0024] 圖4顯示c-Myc為調(diào)節(jié)Parpl表現(xiàn)與PAR基化活性的關鍵因子。圖面A :蛋白質(zhì)印 跡顯示于5日Parpl表現(xiàn)與PAR基化程度，以指定的因子后-MEF細胞轉染。圖面B :以ALP 染色的重新編程細胞顯示表現(xiàn)OSK與混碼shRNA、OSK及c-Myc shRNA或0SK、c-MycshRNA 及Parpl的細胞的相對重新編程效率。圖面C :以c-Myc shRNA處理的多能干細胞中Parpl、 0ct4、S〇x2、Klf4及Nanog的表現(xiàn)以及PAR基化活性。圖面D :包含序列性刪除或點突變小鼠 Parpl啟動子的報告子構筑體的示意表現(xiàn)。圖面E :如圖面D所指出包含序列性刪除或點突 變小鼠 Parpl啟動子的報告子構筑體的螢光酵素活性。圖面F :染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析以IgG或c-Myc Ab用于免疫沉淀，接著借著對Parpl啟 動子使用Cl、C2與C3引子組及對周期蛋白D2啟動子的引子的PCR。圖面G :以qPCR (qChIP) 的圖面F(ChIP)的定量結果。輸入，總溶解產(chǎn)物的2%。蛋白質(zhì)印跡是代表獨立的細胞配制 物的三個分別的實驗。此處所顯示的ALP染色（圖面B)為六個獨立實驗的平均值土SD，而 其他實驗（圖面E和G)系來自三個獨立實驗。于圖面B中，*p〈0. 05對shScr，#P〈0. 05對 shc-Myc。于圖面G中，*p〈0. 05對IgG對照組。
[0025] 圖5顯示Parpl維持多能干細胞中染色質(zhì)-再成型蛋白質(zhì)的PAR基化。圖面A : 于iPSCs中PAR基化的蛋白質(zhì)通過PAR基化的蛋白質(zhì)沉淀試驗法（拉下（pull-down)測定 法）制備并由LC-MS/MS分析。蛋白質(zhì)印跡確認此等鑒定的PAR基化蛋白質(zhì)的表現(xiàn)（Neg : 具突變親和域的陰性樹脂；PAR=PAR親和樹脂）。圖面B:于總溶解產(chǎn)物（輸入）中，蛋白質(zhì) 印跡顯示于重新編程過程期間于多能干細胞中Parpl、Parp2、ChdlL、DNA連接酶III、Ssrpl 與Xrcc6的表現(xiàn)量。圖面C :使用PAR親和樹脂和沉淀試驗法，評估于MEFs、重新編程D6細 胞、重新編程D12細胞、miPSCs、mESCs與Re-7iPSCs中已鑒定的PAR基化蛋白質(zhì)的表現(xiàn)譜 (Con :具有突變親和域的陰性樹脂）。圖面D :共-免疫沉淀顯示Parpl與Parp2、ChdlL、DNA 連接酶III、Xrcc-6及Ssrpl交互作用。圖面E :評估來自iPSC-衍生胚樣體的總蛋白質(zhì)。 圖面F :于iPSC-衍生胚樣體的分化過程期間ParpUChdlUDNA連接酶III、Ssrpl、Xrcc-6 與Parp2的蛋白質(zhì)表現(xiàn)。蛋白質(zhì)印跡是代表獨立的細胞配制物的三個分別的實驗。
[0026] 圖6提供顯示使用Ingenuity IPA分析通過Parpl-交互作用與Parpl-PAR基化 的蛋白質(zhì)于核重新編程與多能性的維持中蛋白質(zhì)-交互作用網(wǎng)路的圖表。
[0027] 圖7顯示iPSCs或iPSC-條件化培養(yǎng)基改進高的潮氣容積-誘導的肺水腫與傷 害（VILI)。圖面A提供肺的總體病理影像，其指出高的潮氣容積_(V T30)誘導的出血、肺充 血水腫及iPSCs或iPSC-條件化培養(yǎng)基的恢復再生效果。圖面B-E提供投予MEF、iPSC或 iPSC-條件化培養(yǎng)基于肺EBD (圖面B)、BAL總蛋白質(zhì)（圖面C)、濕干比（圖面D)與PaO2/ FiO2K (圖面E)在低潮氣容積（VT6)或高潮氣容積（VT30)下于小鼠接收機械通氣的效果。 此處數(shù)據(jù)顯示為三個獨立實驗的平均值土SD(*P〈0. 05對以PBS處理的非通氣對照組；t P〈0. 05對以PBS處理、VT30-通氣的小鼠）。
[0028] 圖8顯示iPSCs或iPSC-條件化培養(yǎng)基回復高的潮氣容積誘導的結構性損傷及嗜 中性球的滲浸。圖面A提供組織的檢查；圖面B提供V T30誘導的呼吸道結構性損傷與iPSCs 或iPSC-條件化培養(yǎng)基的恢復再生效果的定量；及圖面C-F提供投予MEF、iPSC或iPSC-條 件化培養(yǎng)基于嗜中性球的滲浸（圖面C)、ΜΡ0活性（圖面D)、HMGB1分泌（圖面E)與PAI-I 分泌（圖面F)于支氣管肺泡灌洗中在低的潮氣容積（VT6)或高的潮氣容積（VT30)下于小 鼠接收機械通氣的效果。此處數(shù)據(jù)顯示三個獨立實驗的平均值土SD (*P〈0. 05對以PBS處 理的非通氣小鼠；?:Ρ〈〇. 〇5對以PBS處理的VT30-通氣小鼠）。
[0029] 圖9顯示通過iPSC-條件化培養(yǎng)基的超微結構的（ultramicrostructural)復原。 圖面A提供TEM圖像，揭露通過iPSCs或iPSC-條件化培養(yǎng)基治療的呼吸道超微結構的復 原；圖面B-E提供投予iPSC-條件化培養(yǎng)基于MIP2的表現(xiàn)（圖面B)、制造硝酸鹽/亞硝酸 鹽（圖面C)、MDA (圖面D)與GSH(圖面E)于小鼠接收VT30通氣的效果（此處數(shù)據(jù)顯示 三個獨立實驗的平均值土SD ;*P〈0. 05對只以PBS處理的非通氣小鼠（PBS) ;f P〈0. 05對 VT30-通氣小鼠（Vt30));及圖面F提供由細胞介素陣列偵測的iPSC-CM的細胞介素譜。
[0030] 圖10顯示IP-?ο于iPSC-條件化培養(yǎng)基在VILI中修補再生效果的涉入。圖面A提 供定量RT-PCR，指出于V T30通氣小鼠中iPSCs與iPSC-條件化培養(yǎng)基兩者皆招致IP-10 (上 方）、MIG(中間）及i-TAC(下方）的表現(xiàn)；圖面B提供于接收VT30通氣的小鼠中由iPSCs 刺激的IP-10分泌的ELIZA數(shù)據(jù)；及圖面C-E提供IP-10中和抗體投予肺于傷害分數(shù)（圖 面C)、嗜中性球的滲浸（圖面D)與Pa0 2/Fi02K (圖面E)于接收V τ30通氣的小鼠的效果。 此處數(shù)據(jù)顯示三個獨立實驗的平均值土SD。于圖面A中，*Ρ〈0. 05對僅有PBS ;fP〈〇. 05對 RVT30。于圖面B中，*P〈0. 05對MEF-處理的小鼠。于圖面C-E中，*P〈0. 05對無治療的 VT30-通氣小鼠；tP〈〇. 05對以iPSC-CM治療或不以iPSC-條件化培養(yǎng)基治療的IP-10中和 抗體-未治療群組。
[0031] 圖11顯示iPSCs或iPSC-條件化培養(yǎng)基的靜脈下移植改善了博來霉素 (bleomycin)誘導的肺纖維化后的肺傷害。圖面A提供阿士克羅夫特（Ashcroft)肺纖維化 分數(shù)；及圖面B-C分別提供破壞性指數(shù)及平均線性截距（Lm)值，其系于以iPSCs或iPSC-條 件化培養(yǎng)基治療后在7、14與21日獲得。數(shù)據(jù)表示為平均值土SD (*p〈0. 05對于指定日的 博來霉素-處理PBS對照組；η =每群組為6)。
[0032] 圖12顯示iPSCs或iPSC-條件化培養(yǎng)基的靜脈下移植減弱博來霉素誘導的肺纖 維化強度。圖面A-B提供于接受iPSCs或iPSC-條件化培養(yǎng)基的博來霉素處理的小鼠中染 色的第1型膠原蛋白與a -SM的定量；及圖面C提供于在氣管內(nèi)博來霉素注射后14及21 日時來自于接受iPSCs或iPSC-條件化培養(yǎng)基的小鼠肺中的羥脯氨酸含量。數(shù)據(jù)以平均值 土 SD表現(xiàn)（*p〈0. 05對于指定日的博來霉素-處理PBS對照組；η =每群組為5)。
[0033] 圖13提供于被博來霉素傷害的小鼠中在iPSC治療后3日于肺的細胞介素與趨化 激素的變化。圖面A提供以密度測定法定量并以像素密度表現(xiàn)的各個細胞介素與趨化激 素的表現(xiàn)，其中來自被博來霉素傷害的iPSCs或iPSC-條件化培養(yǎng)基接受者的肺蛋白質(zhì)被 萃取并使用細胞介素陣列試驗套組分析；及圖面B-E提供即時PCR結果：IP-10 (圖面B)、 MIG (圖面C)、iTAC (圖面D)及CXCR3 (圖面E)，其在博來霉素-誘導的肺傷害后3日自整 個肺萃取出并分析，其中結果系以倍數(shù)表