異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物及在抗結(jié)核桿菌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物，為： (E)-N' -(3-(3, 4-二羥苯基）丙烯酰）異煙肼，具體涉及該衍生物的制備方法及在制備抗 結(jié)核桿菌藥物中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 藥物性肝病（DIH)是指使用某種或幾種藥物后，由于藥物本身或其代謝產(chǎn)物而引 起的肝損害，氧化應(yīng)激在藥物性肝損傷中具有重要作用。
[0003] 異煙肼（Isoniazid，INH)是目前抗結(jié)核病常用的一線藥物，但是肝臟毒性是異煙 肼的主要不良反應(yīng)，是一種典型的引起藥物性肝病的抗結(jié)核藥物。氧化應(yīng)激在異煙肼引起 的肝損傷中發(fā)揮著重要的作用，目前認(rèn)為，INH在人體內(nèi)主要由其代謝產(chǎn)物肼和乙酰肼經(jīng) CYP2E1氧化代謝引起氧化應(yīng)激，影響肝臟內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，繼而引起肝臟內(nèi)還原型谷胱 甘肽（GSH)等抗氧化物耗竭，超過肝細(xì)胞的解毒功能，并使肝細(xì)胞功能發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致 氧化型肝損傷。其次，INH在體內(nèi)代謝速率快、易產(chǎn)生耐藥性，從INH結(jié)構(gòu)-NH2部位進(jìn)行修 飾，避免-NH2基團(tuán)裸露直接進(jìn)入體內(nèi)，可有效的防止耐藥性的產(chǎn)生，因此肝損傷作用和耐藥 性結(jié)核病的治療提出了很大的挑戰(zhàn)。
[0004] 開發(fā)一種對(duì)肝損傷小且對(duì)耐藥性結(jié)核桿菌有效的抗結(jié)核藥物是一個(gè)急待解決的 問題?？寡趸瘎┚哂星宄杂苫⒖怪|(zhì)過氧化反應(yīng)、保護(hù)肝細(xì)胞膜以及維持機(jī)體氧化一還 原平衡的作用，因此很多抗氧化劑被用于保護(hù)INH等抗結(jié)核藥物所致的氧化性肝損傷。臨 床上采用在長期服用INH等抗結(jié)核藥物時(shí)，同時(shí)配服一定的保肝藥物，如還原型谷胱甘肽、 硫普羅寧、水飛薊賓等，給醫(yī)生和患者帶來不便，效果也不明顯，而且耐藥性問題也沒有有 效解決，臨床上通過抗結(jié)核藥物組合或交替服用，相對(duì)減輕耐藥性的產(chǎn)生，WHO估計(jì)每年新 增49萬多耐藥結(jié)核病例，另外，長期服用即使是以往被認(rèn)為"無毒"或"小毒"的中草藥，長 期或大量應(yīng)用也可致蓄積性中毒，導(dǎo)致肝臟損傷以及其他副作用，影響患者的健康。因此近 年隨著保肝藥物的廣泛使用，屢見相關(guān)不良反應(yīng)的報(bào)道。
[0005] 本發(fā)明公開了一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物，為：(E)-N' -(3-(3,4-二羥苯 基）丙烯酰）異煙肼，解決了已有衍生物不能有效抑制耐藥性結(jié)核桿菌、易引起肝損傷等問 題，該衍生物在抑制耐藥性結(jié)核桿菌活性方面高于異煙肼，而且不易引起肝損傷，相對(duì)于抗 結(jié)核一線藥物異煙肼具有雙重功效，可用于耐藥性結(jié)核病的治療，為制備抗結(jié)核桿菌藥物 提供了一個(gè)新的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物，為：(E)W- (3- (3, 4-二 羥苯基）丙烯酰）異煙肼，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物的 制備方法及在制備抗結(jié)核桿菌藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0008] 本發(fā)明提供了一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物，為（E)-N' -(3-(3,4-二羥苯基） 丙烯酰）異煙肼，其結(jié)構(gòu)式如下：
本發(fā)明提供的一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物的制備方法，制備過程如反應(yīng)式I:
本發(fā)明所述的一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物的制備方法，其中在制備異煙肼咖啡酸 酰胺化衍生物的第一步反應(yīng)中，3, 4-二羥基苯甲醛/丙二酸投料的摩爾比為：1 / 1.5,反 應(yīng)溫度為100~118°C，反應(yīng)時(shí)間為1~2小時(shí)。
[0009] 本發(fā)明所述的一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物的制備方法，其中在制備異煙肼 咖啡酸酰胺化衍生物的第二步反應(yīng)中，第一步反應(yīng)所得的產(chǎn)物咖啡酸作為第二步的反應(yīng)底 物，與氯化亞砜投料的摩爾比為：1 / 1.2~1.5,室溫?cái)嚢?0~30min，緩慢升溫至80~ 90°C，反應(yīng)時(shí)間2~3小時(shí)。
[0010] 本發(fā)明所述的一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物的制備方法，其中在制備異煙肼咖 啡酸酰胺化衍生物的第三步反應(yīng)中，將第二步反應(yīng)所得的產(chǎn)物咖啡酸酰氯溶解在二氯甲烷 中，在冰鹽浴冷卻下加入三乙胺，待反應(yīng)物完全混勻后滴加提前用二甲基甲酰胺溶解好的 異煙肼，30分鐘后移除冰鹽浴，室溫反應(yīng)3~4小時(shí)，用TLCXThinLayerChromatography) 監(jiān)測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后停止反應(yīng)，減壓蒸除溶劑，再將反應(yīng)液倒入IOOmL的冰水中，分別用60mL、 40mL、20mL的乙酸乙酯依次萃取，合并萃取液，萃取液用飽和的NaHCO3及稀鹽酸分別洗滌， 最后用蒸餾水洗滌，將有機(jī)層用CaCl2干燥后濃縮，直接通過柱層色譜分離得到異煙肼咖啡 酸酰胺化衍生物，為（E)-N' -(3-(3, 4-二羥苯基）丙烯酰）異煙肼。
[0011] 本發(fā)明提供了一種異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物在制備抗結(jié)核桿菌藥物中的應(yīng)用， 其機(jī)理為：本發(fā)明是將抗氧化活性較高的化合物咖啡酸與異煙肼通過酰胺鍵連接，在體內(nèi) 水解釋放出異煙肼和咖啡酸，從而產(chǎn)生雙分子，在異煙肼抗結(jié)核桿菌的同時(shí)，抗氧化劑咖啡 酸起到清除異煙肼代謝產(chǎn)生的自由基的作用，從而避免或減輕異煙肼引起的氧化性肝損傷 發(fā)生。
[0012] 本發(fā)明公開的異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物具有以下的優(yōu)勢(shì)： (1)本發(fā)明的異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物具有抑制耐藥性結(jié)核桿菌和抗肝損傷的雙重 功效。
[0013] (2)本發(fā)明的異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物抑制耐藥性結(jié)核桿菌的活性比常規(guī)的異 煙肼活性高。
【附圖說明】
[0014] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0015] 圖1、圖2、圖3、圖4分別是本發(fā)明所述化合物的咖啡酸酰胺化衍生物的IR, 1HNMR, 13CNMR，ESI-HRMS譜圖。
[0016] 圖5是用HPLC的方法測(cè)得的本發(fā)明所述的異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物在血漿中 水解釋放出抗氧化劑咖啡酸的結(jié)果，其中A為異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物的磷酸緩沖溶液 (PBS)在血漿中水解后測(cè)定的HPLC圖，B為對(duì)照品異煙肼的PBS緩沖溶液測(cè)定的HPLC圖， C為咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的HPLC圖，圖中a峰為PBS,b峰為化合物異煙肼，c峰為咖啡酸標(biāo)準(zhǔn) 品；圖6是由圖5分析得到的本發(fā)明所述的異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物在血漿中水解釋放 出抗氧化劑咖啡酸的水解機(jī)理。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例一異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物的制備 1.咖啡酸的制備 將0? 02mol的3, 4-二羥基苯甲醛、0? 03mol的丙二酸和適量催化劑，于118°C攪拌回流 1~2h，TLC檢測(cè)苯甲醛至完全消失至反應(yīng)完全?；亓鹘Y(jié)束后，進(jìn)行水蒸氣蒸餾，除去未反 應(yīng)完的苯甲醛。如顏色較深，可加入2~3g活性炭，煮沸數(shù)分鐘脫色，趁熱過濾，在攪拌下 往熱濾液中加入鹽酸至呈明顯酸性（pH:4~5)。冷卻，待晶體全部析出后，抽濾、水洗、干 燥得粗產(chǎn)物。柱層析分離純化，產(chǎn)物經(jīng)干燥后，即得目標(biāo)產(chǎn)物咖啡酸（3, 4-二羥基桂皮酸)， 稱重，計(jì)算收率。
[0018] 2. 3_ (3,4_二羥基）苯基_2_丙稀醜氣的制備 取反應(yīng)瓶，加入所得的10.Ommol相應(yīng)的咖啡酸，再緩慢滴入12~15mLSOCl2，室溫?cái)?拌20~30min，緩慢升溫至80°C回流2~3h，TLC進(jìn)行反應(yīng)監(jiān)測(cè)，反應(yīng)至無氣體為止，停止加 熱，反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸除未反應(yīng)及過量的二氯亞砜，再加入適量苯，減壓蒸除殘余的SOCl2, 得到淡綠色及黃色等有色液體（3- (3,4_二羥基）苯基-2-丙烯酰氯)，將產(chǎn)物稱重后溶于 適量無水CH2Cl2中備用。
[0019] 3. (E)-N' -(3-(3, 4-二羥苯基）丙烯酰）異煙肼的制備 將溶解在CH2C12中的咖啡酸酰氯置于一干燥的雙口瓶中，在冰鹽浴冷卻下加入I. 5mL(C2H5) 3N，待反應(yīng)物完全混勻后滴加提前用DMF溶解好的異煙肼，30min后移除冰鹽 浴，室溫反應(yīng)3~4h后，TLC進(jìn)行反應(yīng)監(jiān)測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后將混合液倒入IOOmL的冰水中，用 乙酸乙酯（60,40, 20mL)分3次萃取，將萃取后的有機(jī)相合并，用10%的鹽酸洗滌2次，用飽 和的碳酸氫鈉溶液洗滌2次，再用飽和食鹽水，蒸餾水各洗滌1次，加無水硫酸鈉干燥。濃 縮后直接通過柱層色譜分離（MeOH/CHCl3 :1/15作為洗脫劑）得到目標(biāo)化合物異煙肼咖啡 酸酰胺化衍生物（（E)-N' -(3-(3, 4-二羥苯基）丙烯酰）異煙肼)。本實(shí)施例產(chǎn)率為66%， 其結(jié)構(gòu)都采用IR,1HNMR，13CNMR和ESI-HRMS四種方法確認(rèn)。如圖1、圖2、圖3、圖4分別 是本發(fā)明所述化合物的咖啡酸酰胺化衍生物的IR,1HNMR，13CNMR，ESI-HRMS譜圖。
[0020] 產(chǎn)物表征數(shù)據(jù)如下： IR(KBr,cnT1) :v3419, 2253-2127, 1658, 1048-1002,825-763;^ 匪R(400MHz,CD30D-d4)S(ppm) : 6. 44 (d,J=15. 6Hz, 1H)，6. 71-7. 38 (m, 3H)，7. 44 (d,J = 15. 6Hz, 1H), 7. 82 (d,J=6. 0Hz, 2H), 8. 78 (d,J=5. 6Hz, 2H), 9. 34 (br, 2H), 10. 21 (br, 2H).13C匪R(100MHz,CD30D-d4)S(ppm) : 113. 9, 115. 3, 115. 8, 120. 9, 121. 3, 126. 0,I 39. 5, 141. 0, 145. 6, 147. 8, 150. 4, 163. 9, 164. 8 ;ESI-HRMS:m/z300. 0969(calcdfor C16H15N304+H, 300. 0979). 實(shí)施例二異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物體外抑制耐藥性結(jié)核桿菌試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)材料：耐藥性結(jié)核桿菌（H37Rv),由甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院贈(zèng)送。
[0021] Middlebrook7H9由Becton,DickinsonandCompany(BD)提供，培養(yǎng)基其它試劑 為國產(chǎn)分析純。
[0022] 改良的7H9培養(yǎng)基配方：10%的偶氮甲酰胺（ADC)、0. 05%的吐溫-80和0. 5%的丙 三醇、Middlebrook7H9培養(yǎng)基（蒸餾水897. 5ml，Middlebrook7H9粉4. 7g，100%甘油2ml， 100%吐溫800. 5ml)。
[0023] 本實(shí)施例采用2倍稀釋法檢測(cè)本發(fā)明所述化合物對(duì)耐藥性結(jié)核桿菌H37Rv的抑制 作用。
[0024] 首先將實(shí)施例一得到的異煙肼咖啡酸酰胺化衍生物配制成不同濃度的供試溶液， 在改良7H9培養(yǎng)基中分別加入所配的不同濃度的供試溶液，然后在培養(yǎng)基內(nèi)加