)酵母含銅量測定
[0032] 用原子吸收法測定。
[0033] (8)菌種保藏
[0034] 將上述經(jīng)過馴化的富銅海洋紅酵母WYNl保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為：CCTCC No :M 2014592。
[0035] 實施例2 :海洋紅酵母WYNl高產(chǎn)類胡蘿卜素的發(fā)酵條件研宄
[0036] 按單因素實驗考察碳源（包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和淀粉）、氮源（包括酵 母粉、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸銨和尿素）、發(fā)酵時間、PH值及金屬離子（包括銅離子、 鎂離子、鋅離子、亞鐵離子等）等因素對海洋紅酵母WYNl類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。
[0037] (1)不同碳源對海洋紅酵母WYNl類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
[0038] 選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉及乳糖為不同碳源進行發(fā)酵實驗，添加量均為 2%，實驗結(jié)果如表1。
[0039] 表1 :不同碳源對海洋紅酵母WYNl類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
[0040]
[0041] 由表1可以看出：葡萄糖更有利于海洋紅酵母WYNl的生長及色素生成，所以采用 葡萄糖作為最適碳源。
[0042] (2)不同氮源對海洋紅酵母WYNl胞內(nèi)胞外色素含量的影響
[0043] 選取蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸銨、尿素等為不同氮源進行發(fā)酵試驗添 加量為2%。28°C培養(yǎng)48小時，進行海洋紅酵母WYNl的培養(yǎng)，測定細胞生物量及類胡蘿卜 素的含量和產(chǎn)量，結(jié)果見表2。
[0044] 表2 :不同氮源對海洋紅酵母WYNl類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
[0045]
[0046] 由表2可以看出：有機氮源比無機氮源能更好促進酵母菌的生長，其中蛋白胨除 了能促進細胞生長外還能促進胞內(nèi)色素的產(chǎn)生，因此本實驗采用蛋白胨作為最優(yōu)氮源物 質(zhì)。
[0047] (3)正交實驗
[0048] 選擇葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、鹽度四個因素，各取三個水平進行正交實驗，試驗安 排及結(jié)果分析見表3、4。
[0049] 表3 :正交實驗因素水平
[0050]
[0051] 表4:正交實驗安排與結(jié)果
[0052]
[0053] 由表4可知，影響海洋紅酵母WYNl類胡蘿卜素產(chǎn)量的因素大小排序為ABCD，即葡 萄糖的添加量對類胡蘿卜素的產(chǎn)量影響最大。通過正交試驗確定的有利于海洋紅酵母WYNl 產(chǎn)生的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A1B1C2D2，即最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖2. 5%，蛋白胨2. 5%，磷酸二 氫鉀0. 15%，鹽度20。
[0054] (4)發(fā)酵時間對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
[0055] 實驗選取24h、48h、72h、96h、120h等不同時間結(jié)束發(fā)酵，考察不同發(fā)酵時間對海 洋紅酵母WYNl類胡蘿卜素產(chǎn)生的影響，實驗結(jié)果見表5。
[0056] 表5 :不同發(fā)酵時間對海洋紅酵母WYNl類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
[0057]
[0058] 由表5可以看出，發(fā)酵時間越長，細胞生物量及類胡蘿卜素產(chǎn)量越大，但超過48h 后，細胞生物量和類胡蘿卜產(chǎn)量略有下降，因此選擇發(fā)酵時間為48h。
[0059] (5) pH值對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
[0060] 將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至4、5、6、7、8、9進行發(fā)酵試驗，28°C培養(yǎng)48小時，pH 值對細胞生物量及類胡蘿卜素產(chǎn)生的影響見表6。
[0061] 表6 :不同pH對海洋紅酵母WYNl類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
[0062]
[0063] 由表6可以看出，隨著pH值的增加，細胞生物量明顯增加，pH為8時，細胞生物量 達到最大。而類胡蘿卜素含量在pH值小于5時，隨pH的增大而增加；而當pH值大于5.0 時，類胡蘿卜素含量開始減少，這說明PH越高越有不利于色素的產(chǎn)生，pH等于5時，類胡蘿 卜素含量最大。即初始pH為8.0時生物量最大，最適產(chǎn)胞內(nèi)色素的pH值6.0。
[0064] (6)金屬離子的影響
[0065] 在培養(yǎng)基中分別添加硫酸銅、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸鈣等，添加量為0. 025%，考 察各種金屬離子對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見表7。
[0066] 表7 :不同金屬離子對海洋紅酵母WYNl類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
[0067]
[0068] 由表6可以看出，加入銅離子和鋅離子時，能有效地提高細胞生物量及類胡蘿卜 素的產(chǎn)量，硫酸銅的添加量為0.025%時，類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了 24% ;而其他金屬離子 卻能降低類胡蘿卜素的產(chǎn)量。
[0069] (7)發(fā)酵條件控制
[0070] 綜合考慮影響海洋紅酵母WYNl的細胞增殖和胞內(nèi)類胡蘿卜素的含量，發(fā)酵采用 分段控制，即將發(fā)酵過程分為兩個階段：
[0071] 第一階段：接種~發(fā)酵24小時。此階段主要目標是盡可能進行細胞增殖，所以培 養(yǎng)條件為：溫度28°C，pH為8。
[0072] 第二階段：發(fā)酵24小時~48小時。此階段是胞內(nèi)色素積累的重要時期，考慮到有 利于色素的積累，培養(yǎng)條件調(diào)整為：溫度30°C，pH調(diào)整為5,補加一次氮源，即再按照2. 5% 的添加量添加蛋白胨。
[0073] (8)海洋紅酵母WYNl高產(chǎn)類胡蘿卜素的發(fā)酵培養(yǎng)
[0074] 優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖2. 5 %，蛋白胨2. 5 %，硫酸鎂0. 02 %，磷酸二氫鉀 0. 15%，銅含量300mg/L (硫酸銅配置），氯化鈉20%，其余為水；初始pH為8,接種量10%， 搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，28°C培養(yǎng)24小時后，溫度調(diào)整為30°C，pH調(diào)整為5,補加一次氮源， 即再按照2. 5%的添加量添加蛋白胨，繼續(xù)發(fā)酵24h。采用上述方法發(fā)酵培養(yǎng)海洋紅酵母 WYN1，其生物量、類胡蘿卜素產(chǎn)量及胞內(nèi)銅含量分別為27. 52g/L、25. 12mg/L和6240 μ g/g 干菌。
[0075] (9)比較不同發(fā)酵方法下海洋紅酵母WYNl產(chǎn)類胡蘿卜素情況
[0076] ①采用如下培養(yǎng)基配方：蔗糖25. Og/L，酵母膏20. 8g/L，草酸銨4. 2g/L，KH2PO44. Og/L，Na2HPO4 4. Og/L，MgSO4. 7H20 0· 2g/L，CaCl2 0· 2g/L，氟化銨 10mg/L，檸檬酸 30mg/L， L-亮氨酸30mg/L，L-纈氨酸40mg/L，250ml三角瓶中裝液60ml，接種量8%，28°C發(fā)酵48h， 初始pH為7,培養(yǎng)結(jié)束后分離酵母泥測定類胡蘿卜產(chǎn)量，細胞生物量及類胡蘿卜素產(chǎn)量分 別為26. 45g/L和7. 67mg/L (趙玉巧等分離獲得的海洋紅酵母Rhodotorula sp. Z44在同樣 培養(yǎng)基中30°C發(fā)酵66h，類胡蘿卜素產(chǎn)量為6. 72mg/L)。
[0077] ②采用如下培養(yǎng)基配方：蔗糖15g/L、蛋白胨20g/L、NaCl 20g/L、NH4Cl 7.5g/L、 28°C、裝液量80/250mL、發(fā)酵時間48h，培養(yǎng)結(jié)束后分離酵母泥測定類胡蘿卜產(chǎn)量，細胞生 物量及類胡蘿卜素產(chǎn)量分別為20. 22g/L和3. 89mg/L(張志軍等分離分離獲得的海洋紅酵 母Rhodotorula sp. 06在同樣培養(yǎng)基中24°C發(fā)酵72h，類胡蘿卜素產(chǎn)量為3. 04mg/L)。
[0078] ③采用如下培養(yǎng)基配方：葡萄糖45g/L，鹿糖15g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨2. 5g/L， 磷酸二氫鉀lg/L，磷酸二氫鈉3g/L，硫酸鎂7. 5g/L，氯化鉀3g/L，氯化鈉5g/L，培養(yǎng)基初始 pH為7,28°C發(fā)酵48h，類胡蘿卜素產(chǎn)量達到6. 12mg/L (梁曉華等研宄海洋紅酵母Y2在同樣 培養(yǎng)基中20°C發(fā)酵72h，類胡蘿卜素產(chǎn)量達到4. 97mg/L)。
【主權(quán)項】
1. 一株高產(chǎn)類胡蘿卜素的富銅海洋紅酵母，所述海洋紅酵母的保藏編號為：CCTCCNo: M2014592。2. 利用權(quán)利要求1所述的海洋紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，其特征在于，所 述方法如下：發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2. 5%，蛋白胨2. 5%，硫酸鎂0. 02%，磷酸二氫鉀 0. 15 %，銅含量300mg/L，氯化鈉20%，其余為水；初始pH為8,接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速為 180r/min，28°C培養(yǎng)24小時后，溫度調(diào)整為30°C，pH調(diào)整為5,補加一次氮源，即再按照 2. 5%的添加量添加蛋白胨，繼續(xù)發(fā)酵24h。
【專利摘要】本發(fā)明提供一株高產(chǎn)類胡蘿卜素的富銅海洋紅酵母WYN1(Rhodotorula sp.WYN1)，所述菌株已于2014年11月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號為：CCTCC No：M2014592。本發(fā)明所述海洋紅酵母WYN1在含銅培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)能夠高產(chǎn)類胡蘿卜素，具體的方法是：優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.5％，蛋白胨2.5％，硫酸鎂0.02％，磷酸二氫鉀0.15％，銅含量300mg/L，氯化鈉20％，其余為水；初始pH為8，接種量10％，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，28℃培養(yǎng)24小時后，溫度調(diào)整為30℃，pH調(diào)整為5，補加一次氮源，即再按照2.5％的添加量添加蛋白胨，繼續(xù)發(fā)酵24h。CCTCC No:M201459220141125
【IPC分類】C12P23/00, C12R1/645, C12N1/16
【公開號】CN104928199
【申請?zhí)枴緾N201510393528
【發(fā)明人】王亞楠, 程殿林, 叢培江, 孫夢潔, 涂開, 楊婷婷, 劉敏
【申請人】青島大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月1日