平板涂布計數(shù)，用優(yōu)化前的PTYG培 養(yǎng)基作對照，即可測定活菌數(shù)；
[0028] (6)動物雙歧桿菌降膽固醇能力的測定：將純化菌株菌懸液接入到優(yōu)化后的含有 0. lmg/mL膽固醇的培養(yǎng)基中，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)2天，離心，取上清液用 鄰苯二甲醛（OPA)法測其膽固醇去除率，用優(yōu)化前的PTYG培養(yǎng)基作對照，完成測定。
[0029] 實施例 2 Box-Behnken 設計
[0030] Box-Behnken設計是一種通過采用多元二次回歸方程的方法對2-5個因素進行優(yōu) 化。以PB實驗篩選得到的對動物雙歧桿菌乳亞種BZll CGMCC NO. 10224的菌體生長量OD 值影響顯著的幾個因素作為實驗設計因素，以快速登高實驗所得的濃度作為實驗中心點， 以菌體生長量OD值作為響應值，通過響應面來分析培養(yǎng)基成份，從而得到最優(yōu)的培養(yǎng)基組 成成份。實驗設計見表1，實驗結(jié)果見表2,實驗結(jié)果分析見表3。
[0031] 表1 Box-Behnken試驗設計因素水平及其編碼
[0032]
[0033] 表2 Box-Behnken響應面試驗設計結(jié)果
[0034]
[0035]
[0036] 利用Design-Expert軟件對表2中的菌體0D_值以及3個因素進行統(tǒng)計分析，得 到了每個因子的顯著性，其結(jié)果見表3,并得到了菌體0D_值（Y)對自變量麥芽糖含量（A)， 胰蛋白胨（B)和胡蘿卜汁（C)的多元二次回歸方程為：
[0037] Y = +1. 68-0. 016A+0. 026B+0. 016C-0. 022AB+0. 039AC-(2. 750E-003) BC-〇. 014A2- 0. 061B2-(1. 650E-003)C2
[0038] 表3 Box-Behnken響應面試驗方差分析
[0039]
[0041] 注：**極顯著水平（P < 0· 01) ;*顯著水平（P < 0· 05)。
[0042] 由表3的方差分析結(jié)果可知，方程模型的P = 0. 0015 < 0. 01，表明該方程模型極 顯著，也表明方程能很好的擬合試驗結(jié)果。從二次多項回歸模型方程可以看出，方程中因變 量（菌體生長量）與自變量A(麥芽糖含量）和B(胰蛋白胨含量）之間的線性關系明顯， 且回歸方程中的一次項、交互項及二次項項系數(shù)較小，這說明在響應面分析中所選的3個 因素之間其交互效應較顯著。從上述方差分析表中還可以看出，回歸方程的一次項中B極 顯著，說明發(fā)酵液中胰蛋白胨含量（B)對菌體生長量影響顯著；方程中二次項A與C不顯 著，B為極顯著；交互項中AC極顯著，說明麥芽糖含量（A)與胡蘿卜汁含量（C)對菌體生長 量有明顯的交互作用。
[0043] 利用Design-Expert軟件對所得到的回歸模型進行了響應面分析，得到各響應面 的立體分析圖（圖1-6)。并對回歸方程的最值求解，得到了模型極值點，即麥芽糖、胰蛋白 胨、胡蘿卜汁的含量分別為1. 08 %、0. 51 %、14. 33%時，響應值Y值達到最大，即菌體生長 量OD6tltl達到最大為1.714。
[0044] 實施例3動物雙歧桿菌乳亞種BZll的培養(yǎng)
[0045] 將保藏的菌株從_80°C超低溫冰箱中拿出放入37°C水浴鍋中迅速溶解，然后用移 液槍吸取IOOul菌液涂布于PTYG瓊脂培養(yǎng)基上，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)2天。 再用接種環(huán)挑取單菌落接種于PTYG瓊脂培養(yǎng)基上，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)2 天，反復純化3次、鏡檢。將純化好的菌株按接種量10% (w/v)接種于PTYG液體培養(yǎng)基中 進行富集培養(yǎng)，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)2天，作為種子液菌懸液。
[0046] 然后將種子液菌懸液按接種量10% (w/v)接種于利用Design-Expert軟件設計 的17組實驗中（培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基），放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)2天，然后取 出，用紫外分光光度計測其在600nm處的吸光值（A_)，用空白培養(yǎng)基作為對照。每組實驗 做三個平行。
[0047] 以上實施方式僅是本發(fā)明的具體例子，顯然本發(fā)明的實現(xiàn)并不受上述方式的限 制。只要采用本發(fā)明的方法構思和技術方案進行的非實質(zhì)性改進，或未經(jīng)改進將本發(fā)明的 構思和技術方案直接應用于其他場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1. 降膽固醇、耐氧動物雙歧桿菌乳亞種BZll的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基，是 由如下組分組成的：葡萄糖0. 89g、麥芽糖I. 08g、大豆蛋白胨0. 89g、酵母提取物0. 89g、胰 蛋白胨0. 51g、胡蘿卜汁14. 33mL、卷心菜汁17. 78mL、半胱氨酸鹽酸鹽0. 05g、鹽溶液4mL、吐 溫-80 0?lmL，水 10OmT,； 所述鹽溶液的成分為：CaCl2 0? 2g、MgSO4 ? 7H20 0? 48g、K2HPO4lg、KH2PO4lg、NaHCO3 10g、NaCl2g、水 1000mL。2. 如權利要求I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述降膽固醇、耐氧動物雙歧桿菌乳 亞種BZll已于2014年12月18日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，該中 心地址是：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所，其保藏編號 為CGMCCNO. 10224,簡稱為動物雙歧桿菌乳亞種BZ11。3. 如權利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述組分中，胡蘿卜汁、卷心菜汁均是 用常規(guī)方法制備的。4. 用權利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)BZll的方法，其特征在于先將動物雙歧桿菌 BZll接種于種子培養(yǎng)基，于37°C，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天制得發(fā)酵用種子液；接著將發(fā) 酵種子液按照10%的接種量接種于上述發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基中，在37°C、二氧化碳培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)2天，即得。5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基（PTYG培養(yǎng)基）的各組分為： 胰蛋白胨0. 5g、大豆蛋白胨0. 5g、酵母提取物lg、葡萄糖lg、半胱氨酸鹽酸鹽0. 05g、鹽溶 液4mL、吐溫-80 0.ImU水IOOmL;制備方法是將培養(yǎng)基煮沸驅(qū)氧，于121°C下滅菌20min， 即得； 其中，所述鹽溶液的成分為CaCl2 0.2g、MgSO4 .7H20 0.48g、K2HPO4lg、KH2PO4lg、NaHCO3 10g、NaCl2g、水lOOOmL。
【專利摘要】降膽固醇、耐氧動物雙歧桿菌乳亞種BZ11的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由如下組分組成：葡萄糖0.89g、麥芽糖1.08g、大豆蛋白胨0.89g、酵母提取物0.89g、胰蛋白胨0.51g、胡蘿卜汁14.33mL、卷心菜汁17.78mL、半胱氨酸鹽酸鹽0.05g、鹽溶液4mL、吐溫-80 0.1mL，水100mL；所述鹽溶液成分：CaCl2 0.2g、MgSO4·7H2O 0.48g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、NaHCO3 10g、NaCl 2g、水1000mL。本發(fā)酵培養(yǎng)基是一種優(yōu)化培養(yǎng)基，用于發(fā)酵培養(yǎng)BZ11，有效提高菌體生長量，提高降膽固醇能力，發(fā)酵條件溫和，易于控制，有利于擴大生產(chǎn)。
【IPC分類】C12N1/20, A61P3/06, C12R1/01
【公開號】CN104928215
【申請?zhí)枴緾N201510348722
【發(fā)明人】何臘平, 張玲, 李翠芹, 朱秋勁
【申請人】貴州大學
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月23日