一種阿魏酸生產(chǎn)工程菌株、構(gòu)建方法及生物轉(zhuǎn)化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥原料生產(chǎn)技術領域，具體涉及一種能催化丁香酚生成阿魏酸工程菌株、構(gòu)建方法及生物轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術】
[0002]阿魏酸(Ferulic Acid)的化學名稱為4_羥基_3_甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一。由于阿魏酸可以作為微生物發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素的前體物質(zhì)，以及其所具有的抗氧化、抗血栓形成、降血脂、調(diào)節(jié)人體免疫功能等特性，阿魏酸及其衍生物被廣泛應用于降血月旨、防治冠心病和癌癥、抗菌消炎、抗突變、活血通絡、消除黃褐斑，以及失眠、腰酸腿沉等的醫(yī)學治療，保健品生產(chǎn)和食品添加劑領域。
[0003]工業(yè)上可以利用香蘭醛和丙二酸為原料，通過縮合反應化學合成阿魏酸。但該法反應時間長，且生產(chǎn)的為反式和順式阿魏酸的混合物，不易分離，同時化學合成法在環(huán)境污染方面存在一定問題。
[0004]申請?zhí)枮?008101636038的一種天然阿魏酸的制備方法，公開日為2009年5月20日，公開的阿魏酸的制備主要通過物理化學方法從米糠等天然產(chǎn)物中提取，其過程包括乙醇洗滌、100°c高溫氫氧化鈉強堿水解、硫酸酸化沉淀等步驟。該傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的提取工藝復雜，涉及多步高耗能、重污染的環(huán)節(jié)，產(chǎn)生大量的酸堿廢棄物和廢水；同時由于米糠中阿魏酸含量較低，最終提取獲得的產(chǎn)品得率不足0.2%，以上種種因素極大地限制了阿魏酸應用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0005]在微生物體內(nèi)，阿魏酸可以通過一系列代謝途徑合成。如催化丁香酚的氧化反應逐步代謝合成，經(jīng)香蘭醇氧化酶催化生成松柏醇，松柏醇經(jīng)松柏醇脫氫酶催化生成松柏醛，松柏醛最終經(jīng)松柏醛脫氫酶催化獲得阿魏酸。(Highly Efficient B1transformat1nof Eugenol to Ferulic Acid and Further Convers1n to Vanillin in RecombinantStrains of Escherichia col1.Jorg Overhagej Alexander Steinbuchelj and HorstPriefert，Applied and Environmental Microb1logy，2003，6569-6576)在上述反應中，松桕醇脫氫酶的酶促反應需要氧化型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，松桕醛脫氫酶的酶促反應需要氧化型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，因此這兩種輔酶在轉(zhuǎn)化過程中不斷消耗，同時生成的還原型輔酶反饋抑制酶的催化效率，導致中間產(chǎn)物松柏醇、松柏醛大量積累，產(chǎn)能較低，不具有工業(yè)化生產(chǎn)價值。在生產(chǎn)轉(zhuǎn)化過程中添加相應的輔酶，即NADP和NAD可以有效地解決氧化型輔酶不足的問題，大幅度提高阿魏酸生物轉(zhuǎn)化的效率和產(chǎn)量，但由于此類輔酶價格昂貴，穩(wěn)定性低，投加大量輔酶不具有應用可行性。根據(jù)生物催化反應過程的經(jīng)濟性和工業(yè)可行性，必須提供高效、低成本的輔酶再生系統(tǒng)，把輔酶從還原態(tài)再生為氧化態(tài)，從而使輔酶保持在一定的催化劑量水平。
[0006]來源于樹干畢赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖還原酶，可以高效地催化木糖生成木糖醇(Engineering Escherichia coli for Xylitol Product1nFrom Glucose-Xylose Mixtures.Patrick C.Cirinoj Jonathan W.Chin, Lonnie0.1ngram, B1technology and B1engineering)。該酶促反應可以同時利用還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，將二者再生為氧化態(tài)輔酶，底物木糖價格低廉、安全無毒，應用于輔酶再生系統(tǒng)中，可以有效地實現(xiàn)輔酶的平衡，大幅度提高氧化還原酶催化反應的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種高效生產(chǎn)阿魏酸的工程菌株，同時表達香蘭醇氧化酶、松柏醇脫氫酶、松柏醛脫氫酶和木糖還原酶。
[0008]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種阿魏酸生產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法，系統(tǒng)運用酶耦聯(lián)法同時催化兩個平行的酶促氧化還原反應體系，一個酶體系催化底物轉(zhuǎn)化，另一個酶體系催化輔酶循環(huán)再生。體系一中的香蘭醇氧化酶、松柏醇脫氫酶和松柏醛脫氫酶通過三步氧化反應最終催化合成阿魏酸，同時消耗大量氧化型輔酶NAD和NADP，產(chǎn)生相應還原型輔酶。體系二能夠超量表達高活性木糖還原酶，催化木糖生成木糖醇，并將體系一中不斷積累的還原型輔酶NADH和NADPH循環(huán)再生，以維持整個生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的輔酶平衡，促進氧化還原酶促反應的可持續(xù)進行，大幅度提高產(chǎn)物阿魏酸的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。
[0009]本發(fā)明還有一個目的在于提供一種阿魏酸生產(chǎn)工程菌株的生物轉(zhuǎn)化方法。
[0010]本發(fā)明提供的一種阿魏酸生產(chǎn)工程菌株，同時表達香蘭醇氧化酶、松柏醇脫氫酶、松柏醛脫氫酶和木糖還原酶，其中，香蘭醇氧化酶基因、松柏醇脫氫酶基因、松柏醛脫氫酶基因和木糖還原酶基因上游分別整合T7啟動子，在工程菌株中通過T7RNA聚合酶啟動轉(zhuǎn)錄。
[0011]本發(fā)明提供的一種阿魏酸生產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0012](I)、用Nde I和Bam HI分別雙酶切合成的香蘭醇氧化酶基因(vaoA，1683bp)、松柏醇脫氫酶基因(calA，768bp)、松柏醛脫氫酶基因(calB，1446bp)和木糖還原酶基因(xyl, 957bp)，克隆至用Nde I和Bam HI酶切過的pET24a載體上，得重組載體pET24a_vaoA，pET24a_calA、pET24a_calB 和 pET24a_xyl ；
[0013](2)、將重組載體pET24a_vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作為載體，pET24a-calA用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小為900bp片段，與上述載體連接、轉(zhuǎn)化，得重組載體 pET24a-vaoA_calA ；
[0014](3)、將重組載體pET24a-vaoA_calA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作為載體，pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小為1.6kb片段，與上述載體連接、轉(zhuǎn)化，得重組載體 pET24a-vaoA-calA_calB ；
[0015](4)、將重組載體pET24a_xyl用Bam HI和HindIII酶切，回收作為載體，PET24a-vaoA-calA-calB用Bgl II和HindIII酶切，回收大小為4.1kb片段，與上述載體連接、轉(zhuǎn)化，得重組載體 pET24a-xyl-vaoA-calA_calB (pET24a_XVAB)；
[0016](5)、將重組載體pET24a_XVAB轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)，得預期工程菌。
[0017]搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵，采用大腸桿菌在下述條件下培養(yǎng)和發(fā)酵
[0018]I)種子培養(yǎng)基(質(zhì)量百分比)和培養(yǎng)條件:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉I %，余量為純凈水。37°C培養(yǎng)16小時，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為200rpm。
[0019]2)發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨1.2%，酵母提取物2.4%，甘油0.4%，磷酸二氫鉀0.23%，磷酸氫二鉀1.25%，余量為純凈水。
[0020]3)發(fā)酵培養(yǎng)條件:按發(fā)酵體積I %量接種，37°C培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為200rpm ;接種2小時后，降溫至25?28°C加入終濃度0.6mM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)8小時。
[0021]阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化
[0022]I)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，4°C下4000rpm離心收集菌體。
[0023]2) 10mL磷酸緩沖液懸浮菌體，轉(zhuǎn)入250mL轉(zhuǎn)化瓶中，同時添加0.06mL的丁香酚底物和ImL 0.lg/mL木糖。
[0024]3)生物轉(zhuǎn)化條件:25°C反應，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為200rpm，每小時添加0.06mL的丁香酚和ImL 0.lg/mL 木糖。。
[0025]4)轉(zhuǎn)化結(jié)束，通過高效液相色譜(HPLC)檢測阿魏酸產(chǎn)量和純度。
[0026]高效液相色譜法檢測阿魏酸含量
[0027]I)取轉(zhuǎn)化液25 μ L，加入475 μ L甲醇充分混勻，溶解產(chǎn)物。
[0028]2)樣品在4°C低溫下1000rpm離心5min，取上清液。
[0029]3)上清液通過0.45 μ m濾頭過濾，取濾液待測。
[0030]4)高效液相色譜色譜條件:色譜柱為Diamonsil-C18(250mmX4.6mm, 5 μπι);流動相為68:3