一株重組谷氨酸棒桿菌及其在生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和微生物代謝工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一株重組谷氨酸棒 桿菌及其在生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸（5-ALA)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid, 5-ALA)分子式為C5O3NH9，其分子量為 131. 13,熔點為118°C。5-ALA在農(nóng)業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用。研宄表明它是無公害的天然物 質(zhì)，具有生物降解性，因此主要應(yīng)用于綠色除草劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、殺蟲劑等方面。5-ALA 作為一種無公害的新型農(nóng)藥，由于其在環(huán)境中易降解，無殘留，對哺乳動物無毒性，因而受 到越來越多的關(guān)注。另外，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，5-ALA作為一種安全、選擇、滲透性好的光動力學(xué)藥 物，已經(jīng)應(yīng)用于皮膚癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的診斷與光動力治療（PDT)中。
[0003] 目前，5-ALA主要是通過化學(xué)方法合成的。其化學(xué)合成主要集中在以馬尿酸和琥 珀酸為原料的合成工藝研宄、以糠醛等雜環(huán)物質(zhì)為原料的合成工藝研宄及以乙酰丙酸或其 衍生物為原料的合成工藝研宄。但是化學(xué)合成具有工藝步驟多、分離提純難、副產(chǎn)物多、 5-ALA得率低等問題，從而造成生產(chǎn)成本高。除此之外，化學(xué)合成涉及很多有毒試劑，對環(huán) 境也會造成污染。所以隨著社會和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以廉價的可再生資源為底物，利用微生 物發(fā)酵生產(chǎn)5-ALA已是未來的趨勢。目前市場上，葡萄糖價格為4500元/噸，5-ALA價格為 80000000元/噸。所以以廉價的葡萄糖作為原料發(fā)酵產(chǎn)5-ALA，成本上具有極大的優(yōu)勢，并 且還能減少對環(huán)境的污染，值得研發(fā)和推廣。
[0004] 國外的一些文獻報道，通過誘變育種法對光合細菌球形紅細菌（Rhodobacter sphaeroides)誘變，能夠篩選出5-ALA高產(chǎn)菌株，利用其發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸，5-ALA 產(chǎn)量達到了 7. 2g/L。然而由于光合細菌發(fā)酵中采用光照，從而增加了成本，不適合大規(guī)模 工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。隨著基因工程技術(shù)的成熟，人們已經(jīng)采用基因重組技術(shù)將R. sphaeroides 中的5-ALA合成酶基因（hemA)在野生型大腸桿菌中表達。Mariet和Zeikus獲得大腸桿 菌（Escherichia coli)重組菌株，5-ALA發(fā)酵產(chǎn)量達到了 3. 79g/L。Xie等人利用含有 R. sphaeroides的5-ALA合成酶基因的重組大腸桿菌，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，5-ALA產(chǎn)量達到5. 2g/ L。2011年，Kang等人開始C5途徑的研宄，他們將來自于亞利桑那沙門氏菌（Salmonella arizonae)的 hemA 基因（編碼 glutamyl-tRNA reductase)突變后，與 hemL 基因（編碼 glutamate-1-semi aldehyde aminotransferase)在 E. coli 中共表達，同時表達 了 一個由 rhtA基因編碼的5-ALA轉(zhuǎn)運蛋白，使得5-ALA的產(chǎn)量達4. 13g/L。在這些工藝研宄中所使 用的前提物質(zhì)琥珀酸和甘氨酸主要是通過化學(xué)合成法制備，所以其生物轉(zhuǎn)化5-ALA成本較 高，同時由于高濃度的甘氨酸（> I. 7g/L)能夠造成對菌體生長的抑制，使生物轉(zhuǎn)化工藝相 對復(fù)雜。另外，生物轉(zhuǎn)化中所用的培養(yǎng)基為昂貴的LB培養(yǎng)基，這也成為5-ALA工業(yè)化的瓶 頸。所以如何降低發(fā)酵成本及簡化發(fā)酵工藝，成為5-ALA工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。
[0005] 同時，上述5-ALA生產(chǎn)方法主要采用的是模式菌株大腸桿菌，主要包括其C4-途 徑，即通過表達5-ALA合成酶生物轉(zhuǎn)化琥珀酸和甘氨酸來生產(chǎn)5-ALA，或者是利用大腸桿菌 的C5-途徑，即表達外源的hemA和hemL基因以谷氨酸作為前提物質(zhì)來生產(chǎn)5-ALA。既然 5-ALA的C5-合成途徑的前提物質(zhì)是谷氨酸，要是采用能天然生產(chǎn)谷氨酸并且具有安全性 的菌株谷氨酸棒桿菌（Corynebaererium glutamicum)的話，則可無需過多的考慮如何提高 上游代謝途徑的谷氨酸產(chǎn)量的環(huán)節(jié)，這不僅能簡化發(fā)酵工藝途徑，還能大大降低發(fā)酵成本 以及設(shè)備支出，使工業(yè)生產(chǎn)5-ALA的成本顯著下降；另外，谷氨酸棒桿菌廣泛應(yīng)用于食品發(fā) 酵，具有一定的安全性，利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的5-ALA產(chǎn)品對進一步開發(fā)其醫(yī)藥價 值具有積極的作用。然而，經(jīng)檢索，關(guān)于重組谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建和其在生產(chǎn)5-氨基乙 酰丙酸（5-ALA)中的應(yīng)用的專利及文獻還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對目前5-ALA生產(chǎn)中的缺陷，本發(fā)明要解決的問題是提供一株重組谷氨酸棒桿 菌及其在生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸（5-ALA)中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是基于谷氨酸棒桿菌的C5途徑，主要是在谷氨酸棒桿菌中過 量表達ALA的C5合成途徑中協(xié)同表達的編碼glutamyl-tRNA reductase突變體的基因 hemAM和 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase 的基因 hemL，其中，hemA M來源于 亞利桑那沙門沙門氏菌，hemL來源于大腸桿菌，構(gòu)建得到一株重組谷氨酸棒桿菌SEAL ;同 時還過量表達了來源于谷氨酸棒桿菌或沙門氏菌中的hemA基因及其突變體和來源于大腸 桿菌或谷氨酸棒桿菌中的hemL基因，并利用所構(gòu)建的重組菌在無機鹽培養(yǎng)基CGXII內(nèi)以葡 萄糖作為唯一碳源來發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸（5-ALA)。
[0008] 本發(fā)明所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，該重組谷氨酸棒桿菌命名為谷氨 酸棒桿菌SEAL，其基因型為：谷氨酸棒桿菌ATCC13032/pec-SthemAM-EchemL，由如下方法制 得：先克隆得到EchemL基因和突變基因 SthemAM，構(gòu)建含SthemAM和EchemL基因的共表達 載體pec-SthemAM-EchemL，將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pec-SthemAM-EchemL電轉(zhuǎn)入野生型谷氨酸 棒桿菌中，得到過量表達SthemAM和EchemL基因的重組谷氨酸棒桿菌，命名為谷氨酸棒桿 菌SEAL ;其中，所述EchemL基因來源于大腸桿菌，所述SthemAM是來源于亞利桑那沙門沙門 氏菌的hemA基因的突變體，所述表達SthemAM和EchemL基因的載體為穿梭質(zhì)粒pECXK99E， 所述野生型谷氨酸棒桿菌是谷氨酸棒桿菌ATCC13032。
[0009] 本發(fā)明所述重組谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸中的應(yīng)用。
[0010] 上述應(yīng)用方法是：利用所述重組谷氨酸棒桿菌在無機鹽培養(yǎng)基CGXII中發(fā)酵葡萄 糖來生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸；其中，
[0011] 所述無機鹽培養(yǎng)基CGXII配方為：
[0012] 20g/L(NH4)2S04, 5g/L尿素，lg/L KH2PO4, lg/L K2HPO4, 0· 25g/L MgSO4 . 7H20, 42g/ L 3-嗎啉丙磺酸，lOmg/L CaCl2, lOmg/L FeSO4 . 7H20, lOmg/L MnSO4 . H2O, lmg/L ZnSO4 .7H20,0.2mg/L CuS04,0 . 02mg/L NiCl2 . 6H20,0.2mg/L biotin, 40g/L 葡萄糖，0.03mg/L 檸檬酸鈉，〇. 5mM IPTG，50 μ g/mL卡那霉素；
[0013] 所述發(fā)酵葡萄糖的發(fā)酵條件為：
[0014] 菌種接種量以體積百分比計為10±2%，發(fā)酵溫度為30±l°C，pH為6. 5~7. 0,轉(zhuǎn) 速為180±20rpm，發(fā)酵時間為108±2h。
[0015] 進一步的，發(fā)酵溫度優(yōu)選30°C，pH優(yōu)選6. 5,轉(zhuǎn)速優(yōu)選180rpm，發(fā)酵時間為108h。
[0016] 本發(fā)明所述重組谷氨酸棒桿菌在生產(chǎn)5-ALA中的應(yīng)用，具體方法是：
[0017] 搖瓶發(fā)酵：從LB平板上挑取谷氨酸棒桿菌SEAL單菌落接入50mL含有卡那霉素的 LB液體培養(yǎng)基中30°C，180rpm過夜培養(yǎng)。取適當(dāng)體積的菌懸液4°C，12000rpm離心lmin， 收集菌體，并用無菌的生理鹽水洗滌一次，用CGXII培養(yǎng)基重懸后接入含有40g/L葡萄糖的 CGXII培養(yǎng)基中30°C，180rpm進行5-ALA發(fā)酵，初始OD為0. 8-1. 0左右，IPTG濃度為0. 5mM， 每12h取樣測定菌體濃度及5-ALA產(chǎn)量，然后利用比色法檢測5-ALA的濃度，用4M無菌的 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6. 5-7. 0之間，發(fā)酵時間為108 ±2h。
[0018] 5-ALA檢測方法：將樣品稀釋至400 μ L，加入200 μ L的乙酸鹽緩沖液，100 μ L的 乙酰丙酮，然后煮沸15mi