0034](I)蠕動泵:速蠕動泵速度較快，不便于操作，低速蠕動泵，效果更好；
[0035](2)醫(yī)療用帶蓋不銹鋼桶儲存和運(yùn)輸胎盤用；
[0036](3)靜脈穿刺置管套裝。
[0037]有兩個目的，一個用于在胎盤剛娩出后，吸取含抗凝劑-抗生素的培養(yǎng)基，沿臍帶靜脈注射；
[0038]另一個帶管的裝置，用于后續(xù)實驗室操作中，一端插入臍帶靜脈中，絲線固定后，用于沖洗。
[0039](3)血管導(dǎo)管注射接頭
[0040]臍帶有兩條動脈和一條靜脈；用靜脈穿刺管將臍靜脈穿刺，固定，另一端連接液體，用于沖洗；而兩條動脈需要兩根動脈導(dǎo)管，一端插入臍帶動脈，絲線固定后，將另一端插入空的沖洗液收集容器內(nèi)；由裝沖洗液體的容器、蠕動泵、靜脈穿刺針及其導(dǎo)管、胎盤、動脈導(dǎo)管、接收沖洗液體的容器，就可以組成一個完整的沖洗路線；連接順序為1、裝沖洗液的容器(不含干細(xì)胞的培養(yǎng)基)，可用IL的培養(yǎng)基瓶；2、蠕動泵；3、靜脈插管管道及插管接頭；4、臍帶靜脈；5、胎盤；6、動脈插管管道及接頭；7、裝已經(jīng)沖洗的液體(含干細(xì)胞的培養(yǎng)基)。
[0041](4)注射器(50ml，1ml)若干。
[0042]2.胎盤抗凝液
[0043]在胎盤剛剛娩出時，沿臍帶靜脈向胎盤組織中注射的培養(yǎng)基，目的在于:
[0044](I)保證胎盤中的血液不凝固；
[0045](2)提供一個相對殺菌環(huán)境；
[0046](3)保證胎盤血管中細(xì)胞的活性。
[0047]胎盤抗凝液應(yīng)至少包括三種成分:
[0048](I)抗生素，青霉素、鏈霉素和兩性霉素B，用量分別為100U/ml，100ug/ml和1ug/ml ；
[0049](2)肝素:臨床用肝素鈉，終濃度為50U/ml ;
[0050](3)培養(yǎng)基:可用MDM，alpha-MEM。每個胎盤注射量為50ml±5ml ;注射后立即用血管夾，在靠近胎盤側(cè)夾住臍帶，避免液體漏出。
[0051]3、胎盤保存液:
[0052]胎盤抗凝液，但是肝素用量減至10U/ml。或用鹽水或PBS，加入抗生素和肝素。
[0053]4、灌洗液:
[0054]成份為alpha-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、抗生素、肝素(10U/ml);
[0055]初次灌洗用量為100_200ml左右；
[0056]后續(xù)用量在500ml左右，一個胎盤用量500_1000ml。
[0057]5.胎盤干細(xì)胞動員劑:
[0058]成分為在灌洗液基礎(chǔ)上加入趨化因子SDF-lalpha，終濃度為50ng/ml，一般用量為一個胎盤100 ± 5ml。
[0059]6.其它材料:
[0060]淋巴細(xì)胞分離液，比重為1.077g/ml ;刻度吸管，鑷子等細(xì)胞培養(yǎng)必需用品；70um細(xì)胞篩；胎盤注射液:抗凋亡因子(N-乙酰絲氨酸，NAC)
[0061]一種提取胎盤多種干細(xì)胞的方法，由以下步驟組成:
[0062]步驟一、胎盤收集前的處理:
[0063]胎盤娩出后十五分鐘，結(jié)扎臍帶，吸取50ml胎盤抗凝液，裝置靜脈插管接頭，緩慢向胎盤注射，有少量血液從動脈流出即可，立即用血管夾夾住臍帶，位置是胎盤上5厘米，夾緊后，輕輕顛倒胎盤數(shù)次，檢查胎盤完整性，并使液體混勻；將胎盤放入胎盤保存液中，置于運(yùn)輸箱，溫度在20度左右為宜；
[0064]步驟二、胎盤的實驗室處理:
[0065]使用碘伏消毒臍帶及胎盤表面；生理鹽水充分沖洗殘留臍帶和胎盤，至少三次；將臍帶置于相對高處，高度20cm-30cm之間；打開血管夾，插入靜脈導(dǎo)管和動脈導(dǎo)管，連接灌洗液瓶和細(xì)胞收集瓶及蠕動泵，進(jìn)行第一次灌注，液體量在100ml-200ml左右，大部分血液流出，流出的液體變淺，夾住靜脈導(dǎo)管，擠壓胎盤，使殘存血液流出，此時收集的細(xì)胞主要是造血干細(xì)胞，如果處理得當(dāng)，此時收集的造血干細(xì)胞量相當(dāng)于一個臍血單位，打開靜脈導(dǎo)管，夾住動脈導(dǎo)管，將干細(xì)胞動員劑灌入胎盤，用量不超過100ml，將動脈導(dǎo)管和靜脈導(dǎo)管夾住，將導(dǎo)管放入胎盤處理盒，將盒子放入37度培養(yǎng)箱，靜置2小時；取出，放入超凈臺，連接動靜脈導(dǎo)管、灌洗液瓶和細(xì)胞收集瓶；緩慢灌裝，當(dāng)收集的液體透明，說明所有的細(xì)胞均已收集，灌洗液用量500ml-800ml，停止灌洗。步驟三、細(xì)胞處理階段:
[0066]將收集的細(xì)胞懸液大約1L，離心速度為600g，10分鐘，離心去除大量的液體，用alpha-MEM懸浮細(xì)胞沉淀，利用3%醋酸計數(shù)有核細(xì)胞數(shù)；調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 107/ml左右，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心收集單個核細(xì)胞，同時，去除細(xì)胞碎片，離心速度為800g，20分鐘，離心洗滌；810g，10分鐘；使用生理鹽水離心洗滌，500g，10分鐘，使用生理鹽水；利用凍存液懸浮，常規(guī)方法冷凍；
[0067]步驟四、細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)檢:
[0068]流式細(xì)胞學(xué)分析:部分細(xì)胞表達(dá)⑶133和⑶34造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志物。
【主權(quán)項】
1.一種提取胎盤多種干細(xì)胞的方法，由以下步驟組成: 步驟一、胎盤收集前的處理: 胎盤娩出后十五分鐘，結(jié)扎臍帶，吸取50ml胎盤抗凝液，裝置靜脈插管接頭，緩慢向胎盤注射，有少量血液從動脈流出即可，立即用血管夾夾住臍帶，位置是胎盤上5厘米，夾緊后，輕輕顛倒胎盤數(shù)次，檢查胎盤完整性，并使液體混勻；將胎盤放入胎盤保存液中，置于運(yùn)輸箱，溫度在20度左右為宜； 步驟二、胎盤的實驗室處理: 使用碘伏消毒臍帶及胎盤表面；生理鹽水充分沖洗殘留臍帶和胎盤，至少三次；將臍帶置于相對高處，高度20cm-30cm之間；打開血管夾，插入靜脈導(dǎo)管和動脈導(dǎo)管，連接灌洗液瓶和細(xì)胞收集瓶及蠕動泵，進(jìn)行第一次灌注，液體量在100ml-200ml，大部分血液流出，流出的液體變淺，夾住靜脈導(dǎo)管，擠壓胎盤，使殘存血液流出，此時收集的細(xì)胞主要是造血干細(xì)胞，如果處理得當(dāng)，此時收集的造血干細(xì)胞量相當(dāng)于一個臍血單位，打開靜脈導(dǎo)管，夾住動脈導(dǎo)管，將干細(xì)胞動員劑灌入胎盤，用量不超過100ml，將動脈導(dǎo)管和靜脈導(dǎo)管夾住，將導(dǎo)管放入胎盤處理盒，將盒子放入37度培養(yǎng)箱，靜置2小時；取出，放入超凈臺，連接動靜脈導(dǎo)管、灌洗液瓶和細(xì)胞收集瓶；緩慢灌裝，當(dāng)收集的液體透明，說明所有的細(xì)胞均已收集，灌洗液用量500ml-800ml，停止灌洗。步驟三、細(xì)胞處理階段: 將收集的細(xì)胞懸液大約1L，離心速度為600g，10分鐘，離心去除大量的液體，用alpha-MEM懸浮細(xì)胞沉淀，利用3%醋酸計數(shù)有核細(xì)胞數(shù)；調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 107/ml左右，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心收集單個核細(xì)胞，同時，去除細(xì)胞碎片，離心速度為800g，20分鐘，離心洗滌；810g，10分鐘；使用生理鹽水離心洗滌，500g，10分鐘，使用生理鹽水；利用凍存液懸浮，常規(guī)方法冷凍； 步驟四、細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)檢: 流式細(xì)胞學(xué)分析:部分細(xì)胞表達(dá)⑶133和⑶34造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志物，PCR,可檢測到胚胎干細(xì)胞特有標(biāo)記0CT-4表達(dá)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及干細(xì)胞及組織工程領(lǐng)域，特別是一種提取胎盤多種干細(xì)胞的方法。針對現(xiàn)有胎盤多種干細(xì)胞提取中存在的問題與不足，本發(fā)明的目的是提供一種提取胎盤多種干細(xì)胞的方法,克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。其解決問題的技術(shù)方案是：一種提取胎盤多種干細(xì)胞的方法,由以下步驟組成：步驟一、胎盤收集前的處理：步驟二、胎盤的實驗室處理：三、細(xì)胞處理階段：步驟四、細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)檢：這個方法比較簡單易行,不但可以得到胎盤干細(xì)胞，也可以通過消化等手段，從已經(jīng)分離過胎盤干細(xì)胞的胎盤組織中，分離另外三種干細(xì)胞，即造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞。
【IPC分類】C12N5/0775, C12N5/0735, C12N5/0789, C12N5/073
【公開號】CN104928234
【申請?zhí)枴緾N201510395671
【發(fā)明人】郭子寬, 趙靖, 王娟, 李喬麗, 蘆俊萍, 劉瑾, 尹珊
【申請人】河南中科干細(xì)胞基因工程有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月7日