一種刺激軟骨細胞外基質(zhì)分泌的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及軟骨細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種刺激軟骨細胞外基質(zhì)分泌的培養(yǎng) 基。
【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)節(jié)軟骨主要是由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)組成的無血管組織，主要依靠關(guān)節(jié)的運 動和擠壓吸收營養(yǎng)物質(zhì)，所以軟骨損傷后自我修復(fù)能力比較弱，臨床研宄對患者組織取材 有限，并且也因為軟骨細胞是終末分化細胞，體外增殖能力有限且易去分化，去分化是指分 化細胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只毎匦缘倪^程。所以改善與維持軟骨細胞 表型在軟骨細胞的臨床應(yīng)用中起著舉足輕重的作用。
[0003] 目前，為了延遲軟骨細胞的去分化，維持軟骨細胞表型，研宄人員通過改善軟骨細 胞培養(yǎng)環(huán)境來改善與維持所述軟骨細胞表型，在現(xiàn)有技術(shù)中，一是通過改變培養(yǎng)基成分來 改善細胞培養(yǎng)環(huán)境，以改善或維持軟骨細胞表型，二是模擬體內(nèi)培養(yǎng)模式，將軟骨細胞接種 于三維支架材料中對所述軟骨細胞進行培養(yǎng)，使得軟骨細胞回復(fù)初始的軟骨細胞表型，但 是，隨著軟骨細胞的增殖都會出現(xiàn)明顯的去分化趨勢，在體外培養(yǎng)與臨床應(yīng)用上受到了限 制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的主要目的在于，提供一種刺激軟骨細胞外基質(zhì)分泌的培養(yǎng)基，能夠在提 高軟骨細胞增殖能力的同時改善與維持軟骨細胞表型，提高軟骨細胞體內(nèi)應(yīng)用的穩(wěn)定性與 安全性。
[0005] 為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明實施例提供一種刺激軟骨細胞外基質(zhì)分泌的培養(yǎng)基，其特征在于，用于刺 激軟骨細胞分泌軟骨細胞外基質(zhì)，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、骨形成蛋白BMP-2或者其類似物、多 西環(huán)素和地塞米松。
[0007] 優(yōu)選的，所述骨形成蛋白BMP-2在所述培養(yǎng)基中的濃度為2-10ng/ml，所述多西 環(huán)素在所述培養(yǎng)基中的濃度為〇. 1-5 μ mol/ml，所述地塞米松在所述培養(yǎng)基中的濃度為 0.2~2 μ g/ml〇
[0008] 可選的，所述培養(yǎng)基還包括：化學成份確定的脂，所述化學成分確定的脂能夠參與 細胞膜的合成，促進細胞增殖。
[0009] 優(yōu)選的，所述化學成分確定的脂選自膽固醇、維生素 E、亞油酸與油酸中的至少一 種。
[0010] 進一步優(yōu)選的，所述化學成份確定的脂占所述培養(yǎng)基總體積的1-5%。
[0011] 可選的，所述培養(yǎng)基還包括50-100 μ g/ml的維生素 C。
[0012] 進一步可選的，所述培養(yǎng)基還包含3-20ng/ml的堿性成纖維生長因子bFGF和 3-15ng/ml的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β。
[0013] 優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基還包含2-8 μ g/ml的胰島素或者濃度為5-20ng/ml的胰島素 生長因子IGF-I。
[0014] 可選的，所述培養(yǎng)基還包含占所述培養(yǎng)基總體積5-20%的血清。
[0015] 優(yōu)選的，所述血清為胎牛血清或者自體血清。
[0016] 本發(fā)明實施例提供的一種刺激軟骨細胞外基質(zhì)分泌的培養(yǎng)基，用于刺激軟骨細胞 分泌軟骨細胞外基質(zhì)，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、骨形成蛋白BMP-2或者其類似物、多西環(huán)素和地 塞米松。該培養(yǎng)基在培養(yǎng)軟骨細胞時，能夠刺激所述軟骨細胞分泌軟骨細胞外基質(zhì)，所述軟 骨細胞外基質(zhì)包裹所述軟骨細胞，使得軟骨細胞模擬在體內(nèi)的生存方式，在提高軟骨細胞 增殖能力的同時改善與維持軟骨細胞表型，提高軟骨細胞體內(nèi)應(yīng)用的穩(wěn)定性與安全性。
【附圖說明】
[0017] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述 中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些 實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附 圖獲得其它的附圖。
[0018] 圖1為光學顯微鏡拍攝的軟骨細胞材料A-G中的軟骨細胞生長狀態(tài)的光學顯微照 片；
[0019] 圖2為對軟骨細胞材料A-G切片后進行甲苯胺藍染色的光學顯微照片；
[0020] 圖3為對軟骨細胞材料A-G切片后進行II型膠原免疫組化分析的光學顯微照片。
【具體實施方式】
[0021] 現(xiàn)將詳細地提供本發(fā)明實施方式的參考，其一個或多個實例描述于下文。提供每 一實例作為解釋而非限制本發(fā)明。實際上，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見的是，可以對 本發(fā)明進行多種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。例如，作為一個實施方式的部 分而說明或描述的特征可以用于另一實施方式中，來產(chǎn)生更進一步的實施方式。因此，基于 本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0022] 本發(fā)明實施例所涉及的材料均可以通過商業(yè)途徑或通過申請人獲取。
[0023] -方面，本發(fā)明實施例提供一種刺激軟骨細胞外基質(zhì)分泌的培養(yǎng)基，用于刺激軟 骨細胞分泌軟骨細胞外基質(zhì)，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、骨形成蛋白BMP-2或者其類似物、多西環(huán) 素和地塞米松。
[0024] 其中，所述骨形成蛋白BMP-2或者其類似物能夠促進軟骨細胞成熟和分化，和其 他因子有協(xié)同作用，促進軟骨細胞增殖；其中，BMP-2的類似物可以為BMP-4 ;所述多西環(huán)素 經(jīng)試驗證明具有抗菌作用，是一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑劑，能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶對細胞 外基質(zhì)的降解，延緩細胞外基質(zhì)被降解；所述地塞米松可以抑制軟骨細胞過度增殖，能夠促 進細胞分泌蛋白多糖，延緩細胞外基質(zhì)被降解；添加這幾種因子組合得到的軟骨細胞培養(yǎng) 基能夠刺激所述軟骨細胞分泌軟骨細胞外基質(zhì)，改善與維持軟骨細胞表型，提高軟骨細胞 增殖能力。
[0025] 其中，所述細胞外基質(zhì)是由軟骨細胞合成并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞 之間的大分子，主要包含II型膠原和糖胺聚糖等。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連 接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活動。在這些細胞外基質(zhì)中，膠原在細胞外基質(zhì) 中形成半晶體的纖維，給細胞提供抗張力和彈性，并在細胞的迀移和發(fā)育中起作用，是構(gòu)成 細胞外基質(zhì)的骨架。而膠原種類非常多，其中I型、III型主要存在于皮膚血管等結(jié)締組織 中；II型主要由軟骨細胞產(chǎn)生，多存在于骨骼、關(guān)節(jié)、肌腱等組織中，不同類型的膠原蛋白所 起到的作用也不同，I、111型可直接到達皮膚真皮層修復(fù)，美容養(yǎng)顏效果更快速。II型比I、 III型含有更豐富的羥脯氨酸，絲狀的膠原蛋白纖維與彈性蛋白及多糖蛋白相互交織形成網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生一定的機械強度，更適合對骨骼肌腱組織的修復(fù)。
[0026] 軟骨細胞分泌的軟骨細胞外基質(zhì)可影響細胞分化、增殖、黏附、形態(tài)發(fā)生和表型表 達等生物學過程，所述培養(yǎng)基刺激軟骨細胞分泌所述軟骨細胞外基質(zhì)，其中，軟骨細胞外基 質(zhì)包括II型膠原與糖胺聚糖，所述II型膠原與糖胺聚糖包裹所述軟骨細胞，使得軟骨細胞 模擬體內(nèi)生長模式，促進軟骨細胞增殖，改善與維持軟骨細胞表型，同時，軟骨細胞自身分 泌軟骨細胞外基質(zhì)，提高所述軟骨細胞體內(nèi)應(yīng)用的安全性與穩(wěn)定性。
[0027] 本發(fā)明實施例提供的刺激軟骨細胞外基質(zhì)分泌的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基在培養(yǎng)軟骨細 胞時，能夠刺激所述軟骨細胞分泌軟骨細胞外基質(zhì)，所述軟骨細胞外基質(zhì)包裹所述軟骨細 胞，使得軟骨細胞模擬在體內(nèi)生存方式，在提高軟骨細胞增殖能力的同時改善與維持軟骨 細胞表型，提高軟骨細胞體外應(yīng)用的穩(wěn)定性與安全性。
[0028] 其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以為通過商業(yè)途徑獲得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如，可以為DMEM 或者DF12, DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，DF12為F12培養(yǎng)基和DMEM以1 : 1比例混合形成的一種培養(yǎng)基，F(xiàn)12含有較豐富的成分，這兩種培養(yǎng)基能夠為軟骨細胞生長 提供多種營養(yǎng)成分。
[0029] 該基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以為各種形態(tài)，例如，可以為液體形態(tài)或者干粉形態(tài)，針對不同形 式形態(tài)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以采用不同的處理方法配置獲取軟骨細胞培養(yǎng)基。
[0030] 例如，當基礎(chǔ)培養(yǎng)基為干粉形態(tài)時，配置獲取軟骨細胞培養(yǎng)基的方法可以為：先將 干粉形態(tài)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入無菌超純水充分溶解，定容；再用0. 22微米濾膜過濾得到無菌 的澄清溶液；然后根據(jù)軟骨細胞培養(yǎng)基的配方添加其他組分，最終采用酸堿調(diào)節(jié)試劑調(diào)節(jié) pH值至7. 0-7. 5即可。
[0031] 再例如，當基礎(chǔ)培養(yǎng)基為液體形態(tài)時，配置獲取軟骨細胞培養(yǎng)基的方法可以為：取 適量液體形態(tài)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；根據(jù)軟骨細胞培養(yǎng)基的配方添加其他組分，再采用酸堿調(diào)節(jié) 試劑調(diào)節(jié)PH值符合配方要求至7. 0-7. 5即可。
[0032] 其中，在此對所選擇的酸堿調(diào)節(jié)試劑不做限制。優(yōu)選的，可以為10% NaOH或者 10% HClo
[0033] 其中，對所述骨形成蛋白BMP-2、多西環(huán)素和地塞米松的含量不做限定，只要能夠 實現(xiàn)刺激所述軟骨細胞分泌軟骨細胞外基質(zhì)即